라만 화상 진찰 - WITec의 CCD 곱 전자의 원조를 가진 라만 (EMCCD) 향상된 화상 진찰

낙관할 것이다 중요한 요인은 잡음 대 신호 비율 (S/N)입니다. 처음 단계는 라만 집합한 신호를 향상하기 위한 것입니다. 이것은 현미경 및 분광계의 처리량을 낙관해서와 높은 수 가늠구멍을 가진 목적을 사용해서 행해질 수 있습니다 (NA). confocal 준비는 지역에서 쓸모 없는 배경 신호를 탈초점 감소시키는 것을 더 돕고 S/N.를 강화합니다.

가장 높은 감도를 가진 적합한 검출기의 선택은 90% 양 효율성이 있을 수 있는 후에 조명한 CCD와 같은 다음으로 있습니다. 검출기의 소음의 주요 근원 자체는 어두운 소음 및 해독 소음입니다. 목표는 광양자 탄 소음만 남아 있다 그래야, 그밖 소음 근원을 전부 삭제하기 위한 것이어야 합니다.

광양자가 Poisson 통계, 왜냐하면 주어진 신호를 따르기 때문에 불확실은 전자에 있는 신호의 제곱근입니다. 100개의 전자의 신호를 위한 그밖 소음 근원이 없을 경우에, S/N는 10.보다 더 중대할 수 없습니다.

어두운 소음은 CCD의 능률적인 냉각에 의하여 극적으로 감소될 수 있는 CCD에 있는 열로 생성된 운반대 때문이. 좋은 CCD는 0.01 이하 전자/화소의/둘째로 -60°C.에 열 암전류를 비치하고 있습니다. 그러므로, -60°C의 밑에 냉각은의 통합 시간 동안 필요하지 않습니다 몇 초. 라만 confocal 준비에서 것과 같이 100 미만 Ms의 통합 시간을 위해, 암전류는 완전하게 사소합니다. 해독 소음은 집합한 전자를 디지털 조사로 변환하고 있는 동안 일어나고 CCD의 해독 증폭기의 질, 뿐 아니라 해독 프로세스의 속도 (계수화 비율)에 의해 제한됩니다.

해독 소음은 사진기 제조자에 의해 지정되고 전자에서 주어집니다. 전형적인 가치는 2.5 MHz 해독 비율로 대략 30의 전자에 50kHz 해독 비율을 위한 5-10의 전자입니다.

해독 소음이 광양자 탄 소음을 초과하는 경우에, 신호는 제한된 해독 소음을 흔히 말합니다. 일반적인 분광 실험에서 사람은 단순히 신호가 다시 제한된 탄 소음이다는 것을 확인하는 충분한 신호를 취득하는 통합 시간을 증가시킬 것입니다. 불행히도, 이것은 항상 라만 confocal 현미경 검사법에서 가능하지 않습니다.

사람이 단지 1개의 s 통합 시간/스펙트럼을 가진 128의 화소/선 그리고 128의 선으로 이루어져 있는 심상을 취득하는 경우에, 10명의 Ms 통합 시간 동안 100명의 Ms 통합 시간 동안 30 분 미만 또는 3 분 미만으로 감소되는 총 취득 시간 4,5 시간일 것입니다. 불행히도, 검출기에서 읽힌 더 단단 입니다, 더 시끄럽게 해독 증폭기는 됩니다. 50 kHz 해독 증폭기 장비된 1024x128 화소 CCD는 또한 가장 짧은 가능한 통합 시간인 대략 22 Ms에서 소리내어 읽을 수 있습니다. 우리가 10의 전자의 해독 소음을 가정하는 경우에, 100개의 전자/화소 이하 각 신호는 제한된 해독일 것입니다 (Poisson 소음 < 해독 소음). 해독 소음이 단단 해독 증폭기를 위한 30의 전자인 경우에, 900의 전자 (검출기에 ~ 1000 광양자/화소)의 신호 조차 제한된 해독일 것입니다.

CCD를 곱하는 전자는 (EMCCD) 일반적인 CCD 해독 기록기 보다는 매우 더 높은 시계 전압으로 모는 추가 해독 기록기를 가진 일반적인 CCD입니다. , 전자 곱셈은 1000 까지 시간의 신호의 조정가능한 총 확대로 충격 이온화를 통해 이 높은 시계 전압 때문에 달성됩니다. 이 준비로, 비록 아주 단단 해독 증폭기가 사용되더라도 S/N 비율이 신호의 Poisson 소음에 의해 항상 제한되다 그래야 항상 해독 소음의 위 신호를 증폭하는 것이 가능합니다. 한 예로, 이 약품에 있는 실험을 위해 사용되는 것과 같이 2.5 MHz 해독 증폭기를 가진 1600년 x 200 화소 EMCCD는 단지 2.3 Ms에서, 소리내어 읽을 수 있습니다.

뒤에 오는 계산은 다른 신호를 위해 예상될 수 있는 S/N에 있는 개선을 보여줍니다. CCD의 양 효율성이 90% (QE)이다는 것을, 그리고 A/D 조사가 해독 소음 (1개의 A/D 조사 = 2.5 MHz 해독 증폭기를 위한 30의 전자)의 전자의 수를 같게 하다 어느 것이라고 신호의 확대가 가치에에 놓이다 추정됩니다.

100개의 광양자가 주어진 통합 시간에 있는 CCD 화소에 떨어지는 경우에, 90의 전자는 3개의 A/D 조사로 생성되고 변환될 것입니다. 해독 소음은 1개의 A/D 조사이고 대략 0.3 A/D 조사인 Poisson 소음은 9.5일 것입니다. 이 수로, S/N 비율은 대략 2.6입니다.

EMCCD에서는, 신호는 1,000 만큼 높을 수 있는 전자 이익 요인에 의해 곱할 것입니다. 더 작은 증폭 인자는 일반적으로 사용될 것이나, 계산을 위해 효과를 내지 않습니다. 90의 전자는 3,000의 A/D 조사의 결과로 90,000의 전자에 증폭될 것입니다. 317 1개 조사 해독 소음은 완전한 사소한 그러나, 조사로 변환하는 Poisson 소음은 9,500의 전자입니다. 3.6의 요인의 개선인 S/N는 9.5입니다.

신호가 단지 10의 광양자만인 경우에, 이것은 일반적인 CCD를 위한 단지 0.3 조사의 신호 귀착될 것입니다. Poisson 소음은 이 경우에는 무시될 수 있습니다. 1개 조사 해독 소음으로, S/N는 0.3 의 단단하게 탐지가능한 신호입니다.

EMCCD를 위해, 신호는 333 조사이고 3.3의 S/N를 주는 Poisson 소음은 100개 조사, 일반적인 CCD에 11 시간의 개선입니다.

사실상 프로세스 자체를 곱하는 전자는 S/N에 있는 실제적인 개선이 위 보기를 위해 2.6 그리고 7.9로 각각 감소되다 그래야, 대략 1.4의 추가, 소위 과잉 소음 요인을 추가합니다.

신호 강렬이 더 이상 제한된 해독이 아닌 더 높은 신호를 위해, EM 프로세스의 과잉 소음 요인은 아래로 EMCCD의 S/N 비율을 일반적인 CCD의 그것 감소시킵니다. 이런 경우에, EM 기록기는 떨어져 전환될 수 있고 그 때 "일반적인" 해독 기록기는 사용됩니다. 따라서, EMCCD는 정상에 의하여 후에 조명된 CCD로 다만 작동합니다.

FIG. 1은 유리제 준국가에 회전급강하 입히는 극단적으로 얇은 PMMA 필름의 라만 3개의 confocal 심상을 보여줍니다. 심상의 센터에서는, 수직 찰상은 금속 바늘에 PMMA 층을 제거하기 위하여 했습니다. 이 찰상을 통해 AFM로 측정되는 것과 같이 필름 간격은 7.1 nm이었습니다. 4.2 nm 간격의 추가 오염 층이 있었다는 것은 관찰되었습니다. 이 오염 층의 기점과 물자 구성은 처음에 알려지지 않으며 아니라 라만 confocal 측정에 의해 결정될 수 있었습니다.

숫자 1. A.c.: 7.1 nm의 라만 Confocal 심상은 악대 약 3000/cm를 기지개하는 CH2에서 장악된 유리에 PMMA 층을 엷게 합니다. 가늠자 바: 10 μm. FIG. 1d: 견본 30 x 50 μm, 100 x 80 화소의 개략도 = 8000의 스펙트럼, 110 ms/spectrum.

심상은 50 x 50의 μm 검사 범위에 있는 라만 200 x 200의 스펙트럼을 취득하고 3000/cm 주변에 PMMA의 악대를 기지개하는₂ CH의 강렬을 통합해서 장악되었습니다. 흥분 힘은 100x를 사용하여 20 MW @532 nm, NA=0.9 목적이었습니다. FIG. 1a는 62 kHz 해독 증폭기와 (BI) 36명의 Ms 통합 시간/스펙트럼을 사용하여 기준에 의하여 후에 조명된 CCD로 장악되었습니다. 조금 상상으로, 심상의 센터에 있는 찰상은 다만 눈에 보입니다, 그러나 S/N 비율은 1.보다 매우 더 작습니다.

FIG. 1b는 대략 250의 이익을 가진 EMCCD에 imaged 견본의 동일 부분을 보여줍니다. 심상은 동일 S/N를 거의 보여줍니다, 그러나 지금 통합 시간은 더 단단 3.6ms, 심상 1a에서 10 시간만이었습니다. 완전한 심상 취득은 심상 1a를 위한 25 분, 그러나 심상 1b를 위한 단지 3.4 분이 걸렸습니다. FIG. 1c는 EMCCD로, 그러나 지금 FIG. 1a에서와 동일 통합 시간으로 취했습니다. 1개는 PMMA를 통해 구조물 바늘 같이 a의 모양으로 명확하게 찰상, 또한 나중에 토론될 유리제 표면 및 오염을 볼 수 있습니다. FIG. 1d는 견본의 밑그림을 보여줍니다.

다음 심상을 위해, 견본은 혼란되고 NA=1.4를 가진 기름 침수 목적은 사용되었습니다. 통합 시간은 5.4 분의 총 취득 시간의 결과로 7ms/spectrum이었습니다 (후에 검사를 위한 를 포함하여 0.3s/line). FIG. 2는 16 x에서 1,000 X.에 이익 조정 여러가지 동일 조건 하에서 취득된 12의 심상을 보여줍니다. 또 다시, 악대를 기지개하는 CH의 주위에₂ 신호는 심상을 장악하기 위하여 통합되었습니다. 사람이 보는 수 있는 때, S/N 비율은 대략 200 X.의 이익 조정까지 강하게 증가합니다. 이것의 위, S/N에 있는 추가 개선은 심상에서 눈에 보이지 않습니다.

EMCCD 이익의 조정 여러가지 취득되는 라만 confocal 심상의 숫자 2. 비교.

FIG. 3에서는, PMMA의 CH streching 악대에서₂ 신호의 S/N 비율은 EMCCD 이익에 대하여 음모를 꾸밉니다. 신호의 표준 편차는 소음으로 취했습니다. 사람이 보는 수 있는 때, 신호는 최적 조정인 것처럼 보이는 300 x의 이익까지 증가합니다. 이 가치의 위, S/N 가치는 경미하게 다시 줄입니다. 적합한 이익 요인을 사용하여, 전반적인 개선은 5.의 요인 보다는 더 많은 것입니다.

숫자 3. EMCCD 이익에 대하여 음모를 꾸미는 PMMA의 악대를 기지개하는 CH2에서 신호의 S/N 비율.

한정된 confocal 깊이 해결책, 장악된 스펙트럼의 아무도 때문이 오염 층의 순수한 PMMA 스펙트럼 또는 순수한 스펙트럼은. 그러나, 오염 현재 없이 찰상의 지역에서 취득된 모든 스펙트럼을 평균해서, 순수한 유리제 스펙트럼은 장악되었습니다. PMMA 스펙트럼에서 뿐 아니라 오염의 스펙트럼에서 유리제 스펙트럼의 연속적인 감산에 의하여, 순수한 PMMA 및 오염 스펙트럼은 산출될 수 있었습니다. 이 스펙트럼은 각 측정된 스펙트럼이 기본적인 스펙트럼의 선형 조합으로 맞추는 기초 분석을 위해 취했습니다. 이 기술을 사용하여, 그들의 배급 (FIG. 4)를 구상하기 위하여 색으로 구분한 (blue=glass, red=PMMA 및 green=contamination) 3개 분대 (유리, PMMA 및 오염)의 배급을 가진 3개의 심상은 장악될 수 있었습니다. FIG. 5는 다른 분대의 스펙트럼을 보여줍니다. 더 나은 비교를 위해, 그(것)들은 동일한 최대 강렬로 디스플레이됩니다. PMMA 스펙트럼은 유리제 스펙트럼에 관하여 대략 20 시간 및 오염 스펙트럼 대략 15 시간 증폭됩니다.

(파란) 유리에 숫자 4. 라만 색으로 구분하는 confocal (빨간) 7.1 nm PMMA 층 및 4.2개 nm 오염 층 (녹색)의 심상. 200 x 200의 스펙트럼, 7명의 Ms 통합 시간/스펙트럼. 총 취득 시간 5.4 분.

동일한 최대 강렬로 디스플레이되는 FIG. 4에 있는 라만 측정에서 산출되는 숫자 5. 라만 스펙트럼. 가늠자는 PMMA를 위해서만 정확합니다. PMMA 스펙트럼은 유리제 스펙트럼에 관하여 대략 20 시간 및 오염 스펙트럼 대략 15 시간 증폭됩니다.

이것에서, 녹색 스펙트럼 (오염)는 알칸으로 쉽게 확인될 수 있었습니다. 견본은 AFM 간격 수사를 위해 몇 주 라만 측정의 앞에 준비되고 폴리스티렌 콘테이너에서 (PS) 저장되었습니다. 이 PS 콘테이너는 사출 성형에 의해 생성하고 알칸은 더 나은 별거를 위한 형을 입히기 위하여 이용됩니다. 견본이 (아마 온난한 환경에서) 저장되는 때, 알칸의 부분은 또한 입히는 것은 찰상을 포함하다 는 사실과 구조물 바늘 같이 설명하는 견본에 증발하고 압축했습니다.

FIG. 5에 있는 가늠자는 PMMA를 위해 정확하 최대 단지 28 조사를 보여줍니다. 정권 (대략 330/cm 또는₂ 150의 화소를) 기지개하는 완전한 CH에 평균된 신호는 1965 조사입니다. 이 측정을 위한 EM 이익은 대략 600 x이었습니다, 그래서 1965 조사는 단지 99의 전자 (110의 광양자)만에 합계합니다 CCD 화소 당 최대 1.4 광양자 대응하고! 그러나 1개는 어떻게 이렇게 몇몇 전자를 가진 라만 좋은 스펙트럼을 장악할 수 있습니까? 이유는 입니다, 그것은 대략 20,000의 스펙트럼 FIG. 5에서 보인 PMMA 스펙트럼을 산출하기 위하여 평균되었습니다, 그래서 전반적인 신호는 20,000 시간 더 중대합니다. 그러나 PMMA가 나타나 곳에, 그 스펙트럼만 취했습니다. 이것을 위해, 스펙트럼 당 신호는 사람이 평균을 정확한 스펙트럼을 선정할 수 있다 그래야, 충분히 강해야 라만 심상에 있는 PMMA의 배급을 보여주기 위하여 합니다. 보일 수 있다시피, EMCCD 화소 당 1.4 광양자는 충분하게 이 예제에서 PMMA 층의 배급을 구상하고 평균 프로세스를 위한 적당한 스펙트럼을 선택하기 위한 것입니다.

결과는 정권을 기지개하는 CH에 있는 배경 신호 없이 기질이₂ 이용된 경우에 훨씬 감동할 것입니다. FIG. 6은 동일한 강렬 가늠자를 가진 유리, 알칸 및 PMMA의 3개의 스펙트럼을 보여줍니다. 사람이 보는 수 있는 때, 이용된 유리제 기질에는 이 지역에 있는 PMMA의 신호 및 알칸 신호의 대략 1/3의 대략 반을 가진 라만 작은 첨단이 정확하게 있습니다. 라만 시스템의 confocality가 얇은 층의 detectibility를 위해 결정적이다 명백합니다. 최고 confocal 준비로 조차, 의미하는 유리의 500 nm는 라만 신호에 기여한다는 것을 정보 깊이는 적어도 500 nm입니다. 라만 신호가 물자 양에 비례적이기 때문에, 설치된 표준은 (비 confocal) 300 시간 더 높은 (170의 μm 덮개 유리 간격), 탐지를 얇은 입히기의 만들어서 매우 더 긴 통합 시간에 조차 불가능한, 층을 이루다 유리제 신호를 이상의 집합했을 것입니다.

숫자 6. FIG. 5에서와 그러나 정확한 가늠자를 가진 동일 스펙트럼.

EMCCD 사진기의 사용이 매우 탐지 효율성과 속도를 증가시킬 수 있다는 것을 라만 confocal 현미경에 짧은 통합 시간 동안, 특히 설명되었습니다. 유리제 기질에 7.1 nm PMMA 뿐 아니라 4.2개 nm 알칸 층의 배급은 5.4 분으로 200 x 200의 (= 40,000) 스펙트럼 confocal 라만 심상을 위한 전반적인 취득 시간을 감소시킨 스펙트럼 당 단지 7 Ms의 통합 시간으로 쉽게 검출되고 확인될 수 있었습니다. CCD의 해독 소음에 의해 지배되는 아주 작은 신호를 위해, EMCCD의 사용은 최고 유효한 기준 CCD'S와 비교된 5 - 10의 요인에 의하여 더 큰 신호를 위해 회로를 곱하는 전자는 단순히 떨어져 전환되는 수 있고는 표준 (후에 조명된) CCD의 모든 속성이 유지되는 그러나, S/N 비율을 향상할 수 있습니다.

근원: WITec