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简介 Glycan 分析范例准备程序 方法和材料 结果和论述 结论 关于 Beckman 犁刀 简介
抗体或免疫球蛋白是提供被动免疫外部抗原的可溶解血清糖蛋白。 单克抗体 (MAbs) 被开发了作为治疗试剂，因为他们可以特别地对待特殊分子目标与疾病显示相关。 特别是由于关联糖基化，分集有高度在抗体中的功能和结构上的非均匀性。 在单克隆的治疗抗体的糖基化是与他们的结构、生物活性和药物代谢动力学链接的重要之后平移修改。 一定数量不同的碳水化合物份额可能可能地束缚到 MAbs，但是一般了解核心词群双触角和高甘露糖结构组成这个通常关联种类。 MAb 碳水化合物非均匀性分析和测量是重要的，低聚糖与他们的 Fc 地区作用链接了在补全从属的细胞毒性和抗体从属的蜂窝电话细胞毒性的 (CDC)管理规定的重大的作用 (ADCC)。
使用现有的铈技术，与变化的 Glycan 种类在最终 Gal 目录上可以容易地分隔和被分析。 使用激光诱导荧光 (LIF) 检测技术， Glycan 范例准备包括充电和荧光属性的添加使低聚糖电泳分隔然后被定量。
Glycan 分析范例准备程序
glycan 分析范例准备程序如下是列出的：
- 首先，使用 N-glycosidase F (PNGase297 F)，低聚糖从 MAb 中坚的 Asn 残滓分隔。
- 其次，这个荧光团 8-aminopyrene-1， 3， 6 三磺基的酸 (APTS) 如图 1. 所显示，通过与减少有关的氨基化作用被微商数化在低聚糖的减少的末端。
- 电泳分隔被执行使用包括 0.4% 聚乙烯氧化物 (PEO) 的一个聚合物分隔矩阵。 Beckman 犁刀设计并且把技术商业化为了自动化和简化此进程。 显示低聚糖的此基于胶凝体的铈分隔的原则在流动性和水力数量基础上。 这显示一部分由这个情况位置的异构体，虽然相同在质量，可以是解决从互相如图 2. 所显示。
- 在 glycan 结构的修改包括出现 fucose、最终硅铝层酸或者平分的 N-Acetylglucosamine (GlcNAc) 与在 ADCC 活动上的变化相关，因而影响 MAb 效力。
- 作为 fucosylated 和 afucosylated glycans 之间的范围区别是一样小的象他们可能有许多位置的异构体的 16 daltons，并且那，分隔证明困难的为某些种类。
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图 1. glycan 分析概要抽样准备和多种碳水化合物结构。 A. Glycan 对 N 链接的低聚糖的分析的分裂和 APTS 衍生作用方法。 B. 2 个 glycan 种类的示例： 说明想象重要修改 () 和高甘露糖结构的 N 链接的低聚糖 (正确)。
当前方法未能解决共同移居从每别的很大数量的这个少校 glycan 种类。 以前，有能力在分隔 fucosylated 和 afucosylated N 链接的低聚糖上存在了铈情况。
以及成功在铈技术，他们帮助解决在最终 galactosylation 上的区别，建议分隔从彼此以及高甘露糖种类 fucosylated， sialylated 或者被平分的 glycans 应该也是可能的。
方法和材料
在此条款上分析的案例分析中，所有分隔被执行了使用 PA 800 正配药分析系统配置以 488 nm 固体激光和 LIF 检测与放射带通滤波器 (520 ± 10) 毫微米。 N-CHO 血丝为 ligosaccharides 的分隔使用了。 其他检验情况是正如碳水化合物标记和分析检验工具箱的标准操作程序所描述，除之外碳水化合物分隔缓冲用一种新的分隔缓冲公式化替换，其中指示。 低聚糖范例的最终浓度是 1.25 mM。 G0、 G1、 G1’和 G2 的 fucosylated 和 afucosylated 种类的 Glycan 标准从 Glyko ProZyme (Hayward，加州) 被采购了。治疗 MAb 从 Genentech (旧金山，加州) 获得了。
此工作实验详细资料如下是列出的：
- 碳水化合物使用的分隔胶凝体：
- 碳水化合物检验胶凝体 (包含聚乙烯氧化物 (PEO))。
- 新的分隔胶凝体缓冲是 1:1 混合物：
- 碳水化合物分隔胶凝体缓冲 (PEO) - BEC p/n 477623。
- dsDNA1000 分隔胶凝体缓冲 (LPA) - BEC p/n 477628。
- 血丝长度： 总长度 = 60.2 cm，对探测器的长度 = 50 cm。
- 血丝直径： 50 mm I.D。
- 射入情况： 0.5 psi 为 10 秒数除非另外说明。
- 分隔电压： 30 kV。
- 场强： 500 个 volts/cm。
- 血丝子弹温度： 20° C。
- 范例存贮温度： 10° C。
结果和论述
此研究目的将达到主要复杂 glycan 种类的分隔与单克抗体相关。 此 glycan 人口包括低聚糖有和没有核心 fucose 份额、最终半乳糖亚单位，最终硅铝层酸和平分 GlcNAc 残滓以及许多位置的异构体。 现有的分隔化学和 Beckman 犁刀碳水化合物标记 & 分析检验工具箱的分隔限制被分析了。 使用标准协议，获得在 G0， G1 位置的异构体 (包括有仪器配置、范例准备和分隔情况的碳水化合物标记 & 分析检验的 G1 和 G1’) 是可能的和 G2 低聚糖种类 (图 2) 之间的草拟解决方法。
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图 2. G0、 G1 和 G2 glycan 种类分隔。 有代表性的数据 (顶部跟踪) 显示 N 链接的低聚糖 G0、 G1、 G1’和 G2 的分隔使用碳水化合物标记 & 分析检验工具箱 (Beckman 犁刀 p/n 477600) 的。
一个系统的途径被公式化了标准是尖到范例帮助识别在此分隔的另外的峰顶并且更好定义 glycans 共同迁移可能发生。 G0、 G1 和 G2 种类在表 3. 显示。
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碳水化合物分隔缓冲的图 3. 优化允许在接近移居低聚糖对之间的解决方法。 使用标准样品准备协议，铈是 APTS 标记和分隔的低聚糖标准。 共同移居的解决方法通过结合现有的 Beckman 犁刀分隔缓冲实现。 分隔缓冲包括了 1:1 混合物碳水化合物包含 0.4% PEO 和 dsDNA 1000 胶凝体缓冲 (Beckman 犁刀 p/n 477628) 的分隔缓冲 (Beckman 犁刀 p/n 477623) 包含线性聚丙烯酰胺的低百分比 (LPA)。 分隔在 N-CHO 血丝 (p/n 477600) 进行了与一个有效长度的 50 cm。 分隔情况是按照 0.5 psi 射入的 20 kV 5 秒。 场强是 333 个 V/cm。 (a) 严密地移居 fucosylated 和 afucosylated N 链接的低聚糖标准 G0F 和 G1 (红色标签) 以及 G1'F 和 G2 (蓝色标签) 从互相分隔。 (b) 接近移居高甘露糖低聚糖标准从互相分隔。 此分隔解决了从 G0 的从 G0F 的人5，从 G1F 和 G2 的人6 和人7。
钉牢使用低聚糖标准的实验说明单个分隔的峰顶可能包含多个 glycan 种类。 这由 G0+fucose (GoF) 的 G1 以前展示’ +fucose (G1'F) 的共同迁移与 G1 和共同迁移与 G2。 的分隔参数，分隔电压和温度的修改包括血丝长度没有提供被改进的解决方法。 通过开发一种新的分隔缓冲公式化，是可能的改善决心这些共同移居种类 (图 3)。 另外的钉牢的实验显示了被开发的铈分隔的功率 (图 4)。 对于测试在抗体的此分隔方法，治疗 MAb 获得了和其关联 glycans (分析了图 5)。 钉牢与低聚糖标准帮助识别 glycan 种类导致在许多好解决方法主要低聚糖之间，以前是难由铈分隔。
表 1 指示复合用于数据的名字、缩写，以及每个 glycan 种类说明和分子量。
表 1. Glycan 缩写和说明。 此工作其间，标准的分隔使用帮助识别多种 glycan 高峰位置。
| 缩写 | 说明 | 复合名字 | 兆瓦 (Da) |
| - G | Trimannosyl 核心 | M3N2 | 911 |
| - GF | Trimannosyl 核心，替代与 fucose | M3N2F | 1057 |
| 人5 | Oligomannose 5 | 人5 | 1235 |
| G0 | Asialo， agalacto， biantennary 复杂 | NGA2 | 1317 |
| 人6 | Oligomannose 6 | 人6 | 1398 |
| G0F | Asialo， agalacto， biantennary 复杂，核心替代与 fucose | NGA2F | 1463 |
| G1/G1’ | Asialo， monogalactosylated， biantennary 复杂 | NA2G1 | 1480 |
| 人7 | Oligomannose 7 | 人7 | 1560 |
| G1F/G1'F | Asialo，单音galactosylated， biantennary 复杂，核心替代了与 fucose | NA2G1F | 1626 |
| G2 | Asialo， galactosylated， biantennary 复杂 | NA2 | 1641 |
| G0FB | Asialo-， agalacto-， biantennary，核心替代与 fucose 和平分 N-acetylglucosamine (GlcNAc) | NGA2FB | 1667 |
| 人8 | Oligomannose 8 | 人8 | 1722 |
| G2F | Asialo， galactosylated， biantennary 复杂，核心替代与 fucose | NA2F | 1787 |
| 人9 | Oligomannose 9 | 人9 | 1884 |
| G2S1 | 单音sialylate， galactosylated， biantennary 复杂 | A1 | 1933年 |
| G2S1F | 单音sialylate， galactosylated， biantennary 复杂，核心替代与 fucose | A1F | 2079年 |
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碳水化合物分隔缓冲的图 4. 优化允许一定数量的 MAb 关联低聚糖的解决方法。 使用标准样品准备协议，铈是 APTS 标记和分隔的低聚糖标准。 N 链接的低聚糖标准的解决方法通过结合现有的 Beckman 犁刀分隔缓冲实现。
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图 5. 低聚糖分隔联合再组合治疗 MAb。 铈从治疗 MAb， APTS 被劈开了标记和分隔的低聚糖使用新的缓冲公式化。 一定数量的低聚糖种类与此 MAb 相关从互相是解决 (a)。 为了识别和帮助说明在共同移居 glycan 种类之间的解决方法， MAb 范例钉牢与标准 (b)。 相对低聚糖标准，定量 G0、人5、 G0F、 G0FB、人7、 G1F、 G1'F 和 G2F 是可能的。 G2 标准 (在蓝色) 也钉牢到这个混合物指示此低聚糖种类将位于的分隔的地点。
结论
在流动性和水力数量基础上的高分辨率铈分隔为对 glycans 的定量分析被开发了。 使用发布协议和商业可用的试剂，证明，此技术可能分隔有所不同在最终半乳糖的低聚糖。 也显示通过结合标准 PEO 分隔胶凝体缓冲与 LPA 胶凝体缓冲，从 afucosylated N 链接的低聚糖，高甘露糖结构和许多分隔 fucosylated 其他 glycan 份额是可能的。 此工作表明铈可以用于顺利地分隔和定量大多 N 链接的低聚糖与 MAbs 相关。
关于 Beckman 犁刀
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此信息是来源，复核和适应从 Beckman 犁刀提供的材料。
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