CIEF der Hohen Auflösung von Therapeutischen Monoklonalen Antikörpern von pH 4 bis 10

Haarartige Trennung der isoelektrischen (cIEF) Scharfeinstellung für die Charakterisierung von therapeutischen Proteinen ist in zunehmendem Maße in den letzten Jahren angenommen worden. Die Bestimmung von PU fügt eine kritische Abmessung dem Festlegen von Identität, von Reinheit, von nach-Übersetzungsmodifikation und von Stabilität von therapeutischen Proteinvorbereitungen hinzu. Ein signifikanter Anteil cIEF Analysen, die in der biopharmaceutical Industrie durchgeführt werden, beziehen Kennzeichnung von monoklonalen Antikörpern mit ein (mAbs). Viele mAbs haben Ladung isoforms mit einem PU in der grundlegenden Reichweite der pH-Steigung. Grundlegende Mittel bieten eine Herausforderung im cIEF wegen der unzulänglichen Art von den ampholytes an, welche im Laufe der Zeit die grundlegende Region sowie den Zerfall von der Steigung des Loches pH enthalten. Zusatz von kathodischen und anodischen Leitwerken zu den cIEF Beispiellösungshilfen gleichen diese Hindernisse aus. Zusätzlich aktiviert Optimierung von Leitwerklösungsvolumen, Fokussierungszeiten und Ampholytkonzentration Entwicklung einer einzelnen Methode, die während der kompletten pH-Reichweite angewendet werden kann. Diese Strategie aktiviert die Entwicklung eines einzelnen Protokolls für die Produktrohrleitungskennzeichnung, die auch als eine Plattformmethode gekennzeichnet ist. Dieses ist ein wichtiger Aspekt wegen des Bedarfs der Einfachheit halber und der Vielseitigkeit in der biopharmaceutical Industrie. Das Ergebnis dieser Bemühungen ist die Entwicklung einer robusten und tragbaren analytischen Technik, die für Operatorfehler- oder -anlagenvariante weniger anfällig ist.

Die Vorbereitung von mAb-Proben wird durchgeführt, wie nachstehend aufgeführt:

• Ein 500 mLvolumen eines grundlegenden therapeutischen mAb (5-10 mg/ml) wird in ein Microcon* Ultracell YM 10 aufgetaut und belastet (p/n A11530, Nesselkoralle, Billerica, MA).
• Nach Zentrifugierung für Protokoll 5 in einem Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) bei 12 K-rcf, wird das gefilterte Volumen durch Buffer pH 8,0 20 mm Tris ersetzt.
• Zwei zusätzliche Schleifen des Zentrifugierungs- und Bufferaustauschs ist erfolgt und die entsalzte Probe wird aliquoted in ungefähr 50 mgbrüche und bei °C -20 oder unten gespeichert.

Die folgenden Schritte werden in Bezug auf Kapillaren und Reagenzien durchgeführt:

• Ein mm Identifikation Beckman-Kolters 50. Neutrale Kapillare (p/n 477441) ist in eine Haarartige Kassette eingebaut, die mit einem 200 mm-aperture ausgerüstet wird.
• Vor Einbau wurde die Kapillare gemessen, damit seine Gesamtlänge 30,2 cm war und die Länge von Einlass zu Befundfenster 20 cm war und vom Ausgang zum Befundfenster 10 cm waren.
• Anolyte-Lösungen, die 200 mm Phosphorsäure enthalten, wurden wie eine 40 ml-Masse vorbereitet, indem man 550 ml 85% (W/V) verdünnte (M) 14,6 Phosphorsäure (Sigma 438081) mit 39,5 ml doppel-entionisiertem (DDI) Wasser.
• Die Catholyte Lösungen, die 300 mm Natriumhydroxid enthalten, wurden während eine 40 ml-Masse vorbereitet, indem man 12 ml 1 M-Natriumhydroxid (Sigma p/n 72082) in 28 ml DDI-Wasser verdünnte.
• Die Chemischen Mobilizerlösungen, die 350 mm Essigsäure enthalten, wurden während eine 40 ml-Masse vorbereitet, indem man 0,8 ml Eisessig (99,8%), 17,4 M (Sigma p/n 537020) in 39 ml DDI-Wasser verdünnte.

Tabelle 1. VorlagenMischungs-Vorbereitung. Eine cIEF Hauptmischungslösung wurde gemacht, indem man die passenden Teilvolumen mischte. Diese Volumen umfassen ein 20% Überschussvolumen, um das Pipettieren des Fehlers zu erklären. Die einzelne Teilzusammensetzung der Vorlagenmischung enthielt 12 mL von Pharmalyte* 3-10 (GE-Gesundheitswesen p/n 17-0456-01), 20 mL von 500 mm L-Arginin, 2 mL von 200 mm IDA, 1,0 mL von 1,25 mm-Peptid-PU-Markierungen und 200 mL von 3M-ureacIEF Gel.

Die Schritte, die gefolgt werden, um die haarartige Reinigungslösung zu erreichen, sind unten aufgeführt:

• Haarartige Reinigungslösung wurde als Massenlösung durch Auflösungsg 10,8 des Harnstoffs (Sigma p/n U0631) in 30 ml DDI-Wasser gemacht.
• Haarartige Reinigungslösung war Misch, bis alle Körper sich auflösten und dann durch ein Acrodisc* 25 mm-Spritzenfilter mit einer 5-mm-Pore (Hülle p/n 4199) gefiltert waren zum von Partikeln zu löschen.
• Eine 3M-Harnstoff-cIEF Gellösung wurde durch Auflösungsg 1,80 des Harnstoffs (Sigma p/n U1250) in 9 ml von cIEF Gel (p/n 477497) vorbereitet, gemischt für 15 minimal und belastet in eine Spritze 30-mL (Becton Dickenson p/n 309650) und gefiltert dann unter Verwendung einer 5-mm-Pore Acrodisc 25 mm-Spritzenfilter (Hülle p/n 4199) um Partikel zu löschen.
• Die 3M-Harnstoff-cIEF Gellösung wurde bei rcf 2.000 mit einem Allegra X 15 R-Zentrifuge (Beckman-Kolter p/n 392933) entgast und gespeichert bei 2-8 °C.
• Die Kathodische Leitwerklösung, die 500 mm Larginine enthält, wurde wie eine 50 ml-Masse durch zuerst Auflösungs4,36 g von L-Arginin (98%) (Sigma p/n A5006,) gemacht, Körper mit 35 ml DDI-Wasser in einer 50-ml-Maßflasche, dann wurde die Maßflasche gerüttelt, damit Protokoll 15 und das sich auflöst Volumen auf 50 ml mit DDI-Wasser schließlich, erhöhend.
• Die Anodische Leitwerklösung, die 200 mm iminodiacetic Säure enthält, (IDA) wurde wie eine 50 ml-Masse durch zuerst Auflösungsg 1,33 von iminodiacetic saurem (98%) (Sigma p/n 220000,) gemacht, Körper mit 35 ml DDI-Wasser in einer 50-ml-Maßflasche.
• Die Mischung wurde gerüttelt, damit Protokoll 15 alle Körper auflöst und das Volumen wurde auf 50 ml unter Verwendung DDI-Wassers erhöht.
• Die mAb-Bufferaustauschlösung, die 20 mm Tris enthielt, wurde gemacht, indem man 4 ml von Buffer 50 mm Tris bei pH 8,0 (p/n 477427) mit 6 ml DDI-Wasser verdünnte.

Tabelle 2. Probenaufbereitung. Folgendes Mischen der Vorlagenmischung des mL 240, wurde es einem Gefäß hinzugefügt, das eine Aliquote entsalzten mAb enthält. Die komplette Beispiellösung vortexed dann, 200 mL wurde übertragen in ein PCR-Gefäß, bedeckt mit einem einzelnen Absinken von Mineralöl (Sigma p/n 8410-5ML) und gelegt in eine Beispielphiole.

Die Konfiguration des Instrumentes ist, wie folgt:

Die klimatisierende Prozedur, die eingehalten wird, ist unten aufgeführt:

• Nach Anfangseinbau der haarartigen Kassette, wird die neutrale Kapillare klimatisiert, indem man zuerst eine Wasserspülung durchführt, indem man den Einlass der Kapillare in eine Glasphiole eintaucht, die 1,8 ml DDI-Wasser enthält und 50 P/in Druck von der Einlassseite für 2 Min. anwendet.
• Die erweiterte Wasserspülung wird von einer schwachen sauren Wäsche gefolgt, die indem man den Einlass der Kapillare in eine Phiole durchgeführt wird, die, 1,8 ml des chemischen Mobilizer enthält und 50 P/in Druck von der Einlassseite für 2 Min. anwendet eintaucht.
• Schließlich wird ein klimatisierendes Spülen durchgeführt, indem man den Einlass der Kapillare in eine Phiole eintaucht, die 1,8 ml von Beckman-Kolter cIEF Gel enthält und 50 P/in Druck von der Einlassseite für 5 Min. anwendet.

Die mAb-Proben wurden unter Verwendung des folgenden Trennverfahrens getrennt:

• Die Kapillare wird zuerst durch das Eintauchen des Einlasses der Kapillare in eine Phiole gesäubert, die 1,8 ml der haarartigen Reinigungslösung enthält und Druck bei 50 P/in von der Einlassseite für 3 Min. anwendet.
• Nach dem haarartigen Reinigungslösungs-Spülenschritt bündig die Kapillare mit Wasser durch das Eintauchen des Einlasses der Kapillare in eine Phiole, die 1,8 ml DDI-Wasser enthält und 50 P/in Druck von der Einlassseite für 2 Min. anwendet.
• Die Lösung mAb CIEF Beispielwird in die Kapillare durch das Anwenden von 25 P/in Druck für sek 99,9 von der Einlassseite der Kapillare eingeführt.
• Während der Reinigung wird Wasserspülungs- und Beispielladenschritte, die Ausgangsseite der Kapillare in eine überschüssige Phiole gelegt.
• Nach Beispieleinspritzung wird die Steigung fokussiert, indem man die Einlassseite der Kapillare in eine Phiole eintaucht, die 1,8 ml anolyte enthält und die Ausgangsseite der Kapillare in eine Phiole, die 1,8 ml von catholyte enthält und ein 25-KV-elektrisches Potenzial über der Kapillare für 15 Min. anwendet.
• Die fokussierten Spitzen werden chemisch mobilisiert während, welches die catholyte Lösung durch eine Phiole ersetzt wird, die 1,8 ml des chemischen Mobilizer enthält und ein 30-KV-elektrisches Potenzial über der Kapillare für 20 Min. anwendet.
• Nach Beendigung des Mobilisierungsschrittes wird Datenerfassung gestoppt und ein Wasserspülungsschritt wird durchgeführt, indem man den Einlass der Kapillare in eine Phiole eintaucht, die 1,8 ml DDI-Wasser enthält und 50 P/in Druck von der Einlassseite für 2 Min. anwendet.

Die Abschaltenmethode bezieht das folgende mit ein:

• Das Instrument wird abgeschaltet und die Kapillare wird auf dem Instrument am Ende des Arbeitstages unter Verwendung einer Abschaltenmethode gespeichert, die zuerst die Kapillare abglich, indem es den Einlass der Kapillare in eine Phiole eintauchte, die 1,8 ml DDI-Wasser enthält und 50 P/in Druck von der Einlassseite für 2 Min. anwendet.
• Nach der Wasserspülung wird ein klimatisierendes Spülen durchgeführt, indem man den Einlass der Kapillare in eine Phiole eintaucht, die 1,8 ml von Beckman-Kolter cIEF Gel enthält und 50 P/in Druck von der Einlassseite für 10 Min. anwendet.

Abbildung 1. AnfangsBedingungen.

Abbildung 2. Detektor-Einstellungen.

Die Glasphiolen, die 1,6 ml cIEF Trennungsreagenzien enthalten, wurden in die Bufferfächer vor Trennung in der Ordnung gelegt, die in Abbildung 3. dargestellt wurde. Die haarartige Reinigungslösung wird gekennzeichnet durch die Abkürzung „Schutzkappen-Saubere Magnetspule.“ und chemischer Mobilizer durch „Chem. Mob.“ Pfeile zeigen die Reagenzien, die durch das Grundlegende pH-Steigung cIEF Trennverfahren und die Richtung des Erhöhens erhöht werden.

Abbildung 3. Buffer-Fach-Installation.

Die effektive Trennungsreichweite und -linearitäten für den Ampholyt gepufferten pH sind wesentliche Faktoren im cIEF. Die cIEF Trennungen eines Panels der synthetischen Peptidmarkierungen mit PU zeigt, die pH-Reichweite 4,1 bis 10 überspannend (Tabelle 3) wurden unter Verwendung der grundlegenden pH-Reichweitenmethode durchgeführt, um Linearitäten einzuschätzen. Diese Trennung (Feige. 4) zeigt, dass die Methode einen breiten Einsatzbereich hat und zum Trennen der säurehaltigen Peptidmarkierungen sogar fähig ist, wenn die Mobilisierungszeit erweitert ist.

PU-Markierungs-Erkennungszeiten der Tabelle 3. Enthält die PU-Punkte, die Aminosäurereihenfolgen und die Erkennungszeiten für die PU-Markierungstrennung in Abbildung 4.

Abbildung 4. cIEF Trennungen von Synthetischen Peptid-PU-Markierungen. Er enthält ein Elektropherogramm von sieben synthetischen Peptidmarkierungen unter Verwendung des grundlegenden pH-Steigung cIEF Trennverfahrens. Der Mobilisierungsschritt war von 35 bis 40 Minuten erweitert, den Befund der Markierung PUs 4,1 zu aktivieren.

Analyse von PU gegen Erkennungszeit (Feige. 5) für die Chemiefasergewebepeptidmarkierungen zeigt, dass die Steigung zwischen pH 10 und 4,1 mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,99 linear ist. Die In Hohem Grade grundlegenden Proteinspezies nicht richtig fokussiert werden manchmal als Salzvorderseiten verwechselt. Dieses wird in Abbildung 4 als die kathodischen Vorspitzen gezeigt.

Abbildung 5. PU-Markierungs-Lineares Baumuster. Ein Plan von PU-Werten gegen die Erkennungszeit beobachtet für Trennung von synthetischen Peptiden, wie in Tabelle 1. zusammengefasst. Die Mobilisierung der PU-Markierungen befestigt ein lineares Baumuster mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,99 anzeigend, dass die mobilisierte pH-Steigung in hohem Grade linear ist.

mAbs neigen, komplexe Ladung isoform Profile zu erzeugen, wenn sie durch cIEF getrennt werden. Diese Profile zusätzlich zu tatsächlichen PU-Werten für die Spitzen erzeugen einen „mAb-“ Fingerabdruck. Aus diesem Grunde kann cIEF ein leistungsfähiges Hilfsmittel im Kennzeichen und in der Kennzeichnung von unterschiedlichen mAb-Vorbereitungen sein. Das eindeutige Höchstprofil für verschiedene mAbs zeigt, dass eine einzelne Methode unter Verwendung eines breiten PH3 zur Mischung des Ampholyts 10 zum Lösen von Unterschieden bezüglich PUs bis zu einigen Hundertsteln von 1 pH-Gerät über der grundlegenden Reichweite der Steigung fähig ist (Feige. 6).

Abbildung 6. cIEF Trennungen von Drei Grundlegenden mAb. Elektropherogramme für drei grundlegende mAbs trennten sich durch cIEF unter Verwendung der gleichen Bedingungen wie in Abbildung 4. gezeigt.

Um Zwischenpräzision auf diese Methode zu prüfen, wurde ein Panel von drei Antikörpern auf zwei Instrumenten unter Verwendung zwei verschiedener vieler neutraler Kapillare und Reagenzien an sechs verschiedenen Tagen getrennt. Alle Daten waren unter Verwendung 32 KaratTM der Software integriert. PU war durch das Hilfsmittel der qualitativen Analyse unter Verwendung der Erkennungszeiten von Peptidmarkierungen PUs 10 und 7 synthetischen entschlossen. Die Spitzen wurden in eine von drei isoform Gruppen für jeden mAb gruppiert, grundlegend, hauptsächlich und säurehaltig, und eine Prozentzusammensetzung wurde für jede isoform Gruppe berechnet (FIGS. 7-9). Der PU-Punkt von sieben Unterzeichnungsspitzen und die Prozentzusammensetzung von drei isoform Gruppen für jedes der drei geprüften mAbs wurden aufgezeichnet. Diese aufgezeichneten Werte wurden dann verwendet, um Prozentvariationskoeffizienten (%CV) zu berechnen die verwendet wurden, um Wertbestimmungsreproduzierbarkeit abzumessen.

Abbildung 7. HöchstProfil mAb (1). Ein Abschluss herauf Ansicht der Trennung cIEF mAb #1.

Tabelle 4. Quantitative Analyse von Trennung cIEF mAb #1. Quantitative Analyse wurde unter Verwendung des PU-Punktes von sieben Unterzeichnungsspitzen und der Prozentzusammensetzung von drei isoform Gruppen durchgeführt.

Abbildung 8. Spitzen-Profil mAb #2. Ein Abschluss herauf Ansicht einer Trennung cIEF mAb #2.

Tabelle 5. Quantitative Analyse Quantitativer Analyse mAb #2. wurde unter Verwendung der gleichen Methode wie mAb #1. durchgeführt.

Abbildung 9. Spitzen-Profil mAb #3. Ein Abschluss herauf Ansicht einer Trennung cIEF mAb #3.

Tabelle 6. Quantitative Analyse Quantitativer Analyse mAb #3. wurde unter Verwendung der gleichen Methode wie mAb #1. durchgeführt.

Ein einzelnes Trennverfahren kann eingesetzt werden, um cIEF Analyse von mehrfachen mAbs über einer breiten pH-Reichweite durchzuführen. Der Gebrauch von einer einzelnen Methode aktiviert das Vorbereiten von Vorlagentrennungsmischungen, die helfen können Fehler, und Interprobe ariability zu pipettieren zu verringern. Arbeitsfluß wird vereinfacht, indem man eine Plattformmethode anwendet, die Möglichkeiten für Operatorfehler verringert und Gesamtwirkungsgrad in der Methodenentwicklung erhöht. Die analytische Leistung der cIEF Trennungstechnik wird durch die drei sehr verschiedenen Höchstprofile dargestellt, die in jeder mAb-Trennung produziert werden. Die Reproduzierbarkeit des Trennverfahrens wurde gezeigt, indem man eine Reihe Trennungen an sechs verschiedenen Tagen unter Verwendung der mehrfachen Instrumente mit mehrfachen vielen Reagenzien leitete. Statistische Analyse der PU- und isoformgruppenprozentzusammensetzung bestätigt, dass in hohem Grade reproduzierbare cIEF Trennungen von mAbs sogar in der vorher problematischen grundlegenden Region der pH-Steigung erzielt werden können.