CIEF Di alta risoluzione degli Anticorpi Monoclonali Terapeutici da pH 4 a 10

La separazione isoelettrica Capillare (cIEF) di messa a fuoco per la caratterizzazione delle proteine terapeutiche sempre più è stata adottata negli ultimi anni. La determinazione del pi aggiunge una dimensione critica a stabilire l'identità, la purezza, la modifica post-di traduzione e la stabilità dei preparati terapeutici della proteina. Una proporzione significativa di analisi del cIEF che sono effettuate nell'industria biofarmaceutica comprende la caratterizzazione degli anticorpi monoclonali (mAbs). Molti mAbs hanno isoforme della tassa con un pi nell'intervallo di base del gradiente di pH. I composti Di Base offrono una sfida nel cIEF dovuto la natura insufficiente dei ampholytes che comprendono col passare del tempo la regione come pure la disintegrazione di base il gradiente del foro pH. L'Aggiunta degli stabilizzatori catodici ed anodici alle guide della soluzione del campione del cIEF supera questi ostacoli. Ulteriormente, l'ottimizzazione dei volumi della soluzione dello stabilizzatore, i tempi di focalizzazione e la concentrazione nell'anfolito permette all'elaborazione di singolo metodo che può essere usato in tutto l'intervallo completo di pH. Questa strategia permette allo sviluppo di singolo protocollo per la caratterizzazione della conduttura del prodotto anche citata come metodo della piattaforma. Ciò è un aspetto importante dovuto l'esigenza di semplicità e di versatilità nell'industria biofarmaceutica. Il risultato di questi sforzi è lo sviluppo di una variazione robusta e portatile a errore dell'operatore meno incline analitico o del sistema di tecnica.

Il preparato dei campioni di mAb è realizzato come quotato qui sotto:

• I 500 volumi di mL di mAb (5-10 mg/ml) terapeutico di base sono sciolti e caricati in un Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530, Millipore, Billerica, MA).
• Dopo centrifugazione per il minuto 5 in un Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) ad un rcf di 12 K, il volume filtrato è sostituito con un buffer il pH 8,0 da 20 millimetri Tris.
• Due cicli supplementari della sostituzione del buffer e di centrifugazione è fatto ed il campione desalificato aliquoted in circa 50 frazioni di mg ed è memorizzato a °C -20 o sotto.

Le seguenti operazione sono eseguite riguardo ai capillari ed ai reagenti:

• Un'identificazione di mm del Coltro 50 di Beckman. Il Capillare Neutrale (p/n 477441) è installato in una Cartuccia Capillare fornita dei 200 aperture di millimetro.
• Prima di impianto, il capillare è stato misurato in modo che la sua lunghezza totale fosse 30,2 cm e la lunghezza dall'entrata alla finestra di rilevazione fosse 20 cm e dallo sbocco alla finestra di rilevazione provenissero 10 cm.
• Le soluzioni di Anolyte che contengono 200 millimetri di acido fosforico sono state preparate come una massa da 40 ml, diluendo 550 ml di 85% (p/V) (M) 14,6 acido fosforico (Sigma 438081) con 39,5 ml di acqua (DDI) doppio deionizzata.
• Le soluzioni Catholyte che contengono 300 millimetri di idrossido di sodio sono state preparate mentre una massa da 40 ml diluendo 12 ml di idrossido di sodio da 1 M. (Sigma p/n 72082) in 28 ml di acqua di DDI.
• Le soluzioni Chimiche del mobilizer che contengono 350 millimetri di acido acetico sono state preparate mentre una massa da 40 ml diluendo 0,8 ml di acido acetico glaciale (99,8%), 17,4 M. (Sigma p/n 537020) in 39 ml di acqua di DDI.

Preparato Matrice della Miscela della Tabella 1. Una soluzione della miscela del supervisore del cIEF è stata fatta mescolando i volumi componenti appropriati. Questi volumi comprendono un volume di eccedenza di 20% per rappresentare il prelevamento dell'errore. La singola composizione della parte della miscela matrice ha contenuto 12 mL di Pharmalyte* 3-10 (Sanità p/n 17-0456-01 di GE), 20 mL di 500 millimetri di L-Arginina, 2 mL di 200 millimetri IDA, 1,0 mL degli indicatori del peptide pi da 1,25 millimetri e 200 mL del Gel del ureacIEF di 3M.

I punti seguiti per ottenere la soluzione capillare di pulizia sono elencati qui sotto:

• La soluzione Capillare di pulizia è stata fatta come soluzione in serie dal g 10,8 di dissoluzione di urea (Sigma p/n U0631) in 30 ml di acqua di DDI.
• La soluzione Capillare di pulizia era mista finché tutti i solidi non si dissolvessero e poi fossero filtrati attraverso un Acrodisc* filtro dalla siringa da 25 millimetri con un poro di 5-mm (Cappa p/n 4199) per rimuovere le particelle.
• Una soluzione del gel dell'urea-cIEF di 3M è stata preparata dal g 1,80 di dissoluzione di urea (Sigma p/n U1250) in misto 9 ml di gel del cIEF (p/n 477497), per 15 minimi ed è stata caricata 30-mL in una siringa (Becton Dickenson p/n 309650) e poi è stata filtrata facendo uso di un poro Acrodisc di 5-mm il filtro dalla siringa da 25 millimetri (Cappa p/n 4199) per rimuovere le particelle.
• La soluzione del gel dell'urea-cIEF di 3M è stata degassata a rcf 2.000 con un Allegra X una centrifuga di 15 R (Coltro p/n 392933 di Beckman) ed è stata memorizzata a 2-8 °C.
• La soluzione Catodica dello stabilizzatore che comprende 500 millimetri Larginine è stata fatta come una massa da 50 ml da 4,36 in primo luogo di dissoluzione g di L-Arginina (98%) (Sigma p/n A5006) solido con 35 ml di acqua di DDI in un matraccio tarato da 50 ml, quindi il matraccio tarato è stato scosso affinchè il minuto 15 si dissolva e definitivo aumentando il volume a 50 ml con acqua di DDI.
• La soluzione Anodica dello stabilizzatore che contiene 200 millimetri di acido iminodiacetic (IDA) è stata fatta come una massa da 50 ml dal g 1,33 in primo luogo di dissoluzione di acido iminodiacetic (98%) (Sigma p/n 220000) solido con 35 ml di acqua di DDI in un matraccio tarato da 50 ml.
• La miscela è stata scossa affinchè il minuto 15 dissolva tutti i solidi ed il volume è stato aumentato a 50 ml facendo uso dell'acqua di DDI.
• La soluzione della sostituzione del buffer di mAb che ha contenuto 20 millimetri Tris è stata fatta diluendo 4 ml di buffer da 50 millimetri Tris a pH 8,0 (p/n 477427) con 6 ml di acqua di DDI.

Preparato del Campione della Tabella 2. Mescolanza Seguente della miscela matrice di mL 240, si è aggiunto ad un tubo che contiene un'aliquota del mAb desalificato. La soluzione completa del campione poi vortexed, 200 mL è stata trasferita in un tubo di PCR, è stata sovrapposta di singola goccia di olio minerale (Sigma p/n 8410-5ML) ed è stata collocata in una fiala del campione.

La configurazione dello strumento è come segue:

La procedura di condizionamento seguita è elencata qui sotto:

• Dopo impianto iniziale della cartuccia capillare, il capillare neutrale è condizionato in primo luogo eseguendo una risciacquatura con acqua sommergendo l'entrata del capillare in una fiala di vetro che contiene 1,8 ml di acqua di DDI e che applica 50 PSI di pressione dal lato dell'entrata per 2 Min.
• La risciacquatura con acqua estesa è seguita da un lavaggio acido debole eseguito sommergendo l'entrata del capillare in una fiala che contiene 1,8 ml di mobilizer chimico e che applica 50 PSI di pressione dal lato dell'entrata per 2 Min.
• Definitivo un risciacquo di condizionamento è eseguito sommergendo l'entrata del capillare in una fiala che contiene 1,8 ml di gel del cIEF del Coltro di Beckman e che applica 50 PSI di pressione dal lato dell'entrata per 5 Min.

I campioni di mAb sono stati separati facendo uso di seguente metodo di separazione:

• Il capillare in primo luogo è pulito sommergendo l'entrata del capillare in una fiala che contiene 1,8 ml di soluzione capillare di pulizia e che applica la pressione a 50 PSI dal lato dell'entrata per 3 Min.
• A Seguito del punto capillare del risciacquo della soluzione di pulizia, il capillare a livello di acqua sommergendo l'entrata del capillare in una fiala che contiene 1,8 ml di acqua di DDI e che applica 50 PSI di pressione dal lato dell'entrata per 2 Min.
• La soluzione del campione di mAb CIEF è introdotta nel capillare applicando 25 PSI di pressione per sec 99,9 dal lato dell'entrata del capillare.
• Durante la pulizia, i punti di caricamento del campione e della risciacquatura con acqua, la mandata del capillare è collocato in una fiala residua.
• Dopo l'iniezione del campione, il gradiente è messo a fuoco sommergendo il lato dell'entrata del capillare in una fiala che contiene 1,8 ml di anolyte e della mandata del capillare in una fiala che contiene 1,8 ml di catholyte e che applica un potenziale elettrico di 25 chilovolt attraverso il capillare per 15 Min.
• I picchi messi a fuoco sono mobilizzati chimicamente durante il cui la soluzione catholyte è sostituita con una fiala che contiene 1,8 ml di mobilizer chimico e che applica un potenziale elettrico di 30 chilovolt attraverso il capillare per 20 Min.
• Dopo il completamento del punto di smobilizzo, la raccolta di dati è interrotta e un'operazione della risciacquatura con acqua è eseguita sommergendo l'entrata del capillare in una fiala che contiene 1,8 ml di acqua di DDI e che applica 50 PSI di pressione dal lato dell'entrata per 2 Min.

Il metodo di arresto comprende quanto segue:

• Lo strumento è interrotto ed il capillare è memorizzato sullo strumento alla conclusione del giorno lavorativo facendo uso di un metodo di arresto che in primo luogo ha equilibrato il capillare sommergendo l'entrata del capillare in una fiala che contiene 1,8 ml di acqua di DDI e che applica 50 PSI di pressione dal lato dell'entrata per 2 Min.
• Dopo la risciacquatura con acqua, un risciacquo di condizionamento è eseguito sommergendo l'entrata del capillare in una fiala che contiene 1,8 ml di gel del cIEF del Coltro di Beckman e che applica 50 PSI di pressione dal lato dell'entrata per 10 Min.

Figura 1. Circostanze Iniziali.

Figura 2. Impostazioni del Rivelatore.

Le fiale Di Vetro che contengono 1,6 ml di reagenti della separazione del cIEF sono state collocate nei cassetti del buffer prima della separazione nell'ordine illustrato nella Figura 3. La soluzione capillare di pulizia è designata dall'abbreviazione “Solenoide Pulito del Cappuccio.„ e mobilizer chimico “da Chem. Mob.„ Le Frecce mostrano i reagenti che sono incrementati tramite il Metodo di Separazione Di Base del cIEF di Gradiente di pH e la direzione di incrementare.

Figura 3. Impostazione del Cassetto del Buffer.

L'efficaci intervallo e linearità della separazione per il pH bufferizzato anfolito sono fattori essenziali nel cIEF. Le separazioni del cIEF di comitato degli indicatori sintetici del peptide con il pi indica misurando l'intervallo di pH di 4,1 - 10 (Tabella 3) è stata eseguita facendo uso del metodo di base dell'intervallo di pH per valutare le linearità. Questa separazione (Fig. 4) indica che il metodo ha un ampio intervallo funzionale ed è anche capace di separazione degli indicatori acidi del peptide quando il tempo di smobilizzo è esteso.

Periodi Di Individuazione Dell'Indicatore della Tabella 3. pi. Contiene i punti di pi, le sequenze aminoacidiche ed i periodi di individuazione per la separazione degli indicatori di pi nella Figura 4.

Figura 4. Separazioni del cIEF degli Indicatori Sintetici del Peptide pi. Contiene un elettroferogramma di sette indicatori sintetici del peptide facendo uso del metodo di separazione di base del cIEF di gradiente di pH. Il punto di smobilizzo era esteso da 35 a 40 minuti permettere alla rilevazione dell'indicatore di pi 4,1.

Analisi del pi contro periodo di individuazione (Fig. 5) per gli indicatori sintetici del peptide indica che il gradiente è lineare fra pH 10 e 4,1 con un coefficiente di correlazione di 0,99. Le specie Altamente fondamentali della proteina messe a fuoco non correttamente a volte sono confuse come parti anteriori del sale. Ciò è indicata nella Figura 4 come i pre-picchi catodici.

Figura 5. Modello Lineare dell'Indicatore di pi. Un tracciato dei valori di pi contro periodo di individuazione osservato per la separazione di peptidi sintetici come riassunto nella Tabella 1. Lo smobilizzo degli indicatori di pi misura un modello lineare con un coefficiente di correlazione di 0,99 che indica che il gradiente mobilizzato di pH è altamente lineare.

i mAbs tendono a generare i profili complessi di isoforma della tassa una volta separati da cIEF. Questi profili oltre ai valori reali di pi per i picchi generano un'impronta digitale “di mAb„. È per questo motivo che il cIEF può essere uno strumento potente nell'identificazione e nella caratterizzazione dei preparati separati di mAb. Il profilo di punta unico per i mAbs differenti indica che un singolo metodo facendo uso di vasto PH3 alla miscela dell'anfolito 10 è capace di risoluzione delle differenze nel pi fino ad alcuni centesimi di 1 unità di pH attraverso l'intervallo di base del gradiente (Fig. 6).

Figura 6. le Separazioni del cIEF di Tre mAb Di Base. Gli Elettroferogrammi per tre mAbs di base hanno separato da cIEF facendo uso delle stesse circostanze secondo le indicazioni di Figura 4.

Per verificare la precisione intermedia a questo metodo, un comitato di tre anticorpi è stato separato su due strumenti facendo uso di due lotti differenti del capillare neutrale e sui reagenti sei giorni separati. Tutti I dati sono stati integrati facendo uso del software di 32 KaratTM. il pi era risoluto tramite lo strumento di analisi qualitativa facendo uso dei periodi di individuazione degli indicatori sintetici del peptide di pi 10 e 7. I picchi sono stati raggruppati in uno di tre gruppi di isoforma per ogni mAb, di base, principale ed acido e una composizione nelle percentuali è stata calcolata per ogni gruppo di isoforma (Fichi. 7-9). Il punto di pi di sette picchi dell'impronta e la composizione delle percentuali di tre gruppi di isoforma per ciascuno dei tre mAbs provati sono stati registrati. Questi valori registrati poi sono stati usati per calcolare i coefficienti di variazione delle percentuali (%CV) che sono stati usati per misurare la riproducibilità di analisi.

Figura 7. mAb (1) Profilo Di Punta. Una visualizzazione alta di fine della separazione del cIEF di mAb #1.

Analisi Quantitativa della Tabella 4. della Separazione del cIEF di mAb #1. L'analisi Quantitativa è stata eseguita facendo uso del punto di pi di sette picchi dell'impronta e della composizione delle percentuali di tre gruppi di isoforma.

Figura 8. Profilo del Picco di mAb #2. Una visualizzazione alta di fine di una separazione del cIEF di mAb #2.

L'Analisi Quantitativa della Tabella 5. dell'analisi Quantitativa di mAb #2. è stata eseguita facendo uso dello stesso metodo del mAb #1.

Figura 9. Profilo del Picco di mAb #3. Una visualizzazione alta di fine di una separazione del cIEF di mAb #3.

L'Analisi Quantitativa della Tabella 6. dell'analisi Quantitativa di mAb #3. è stata eseguita facendo uso dello stesso metodo del mAb #1.

Un singolo metodo di separazione può essere impiegato per eseguire l'analisi del cIEF dei mAbs multipli attraverso un vasto intervallo di pH. L'uso di singolo metodo permette a preparare le miscele matrici della separazione che possono contribuire a diminuire pipettare gli errori e il ariability del inter campione. Il Flusso Di Lavoro è semplificato usando un metodo della piattaforma, la diminuzione delle probabilità per l'errore dell'operatore e l'aumento del risparmio di temi globale di sviluppo di metodo. La potenza analitica della tecnica di separazione del cIEF è illustrata dai tre profili di punta molto differenti prodotti in ogni separazione di mAb. La riproducibilità del metodo di separazione è stata dimostrata conducendo una serie di separazioni sei giorni separati facendo uso degli strumenti multipli con i lotti multipli dei reagenti. L'analisi Statistica della composizione delle percentuali del gruppo di isoforma e di pi conferma che le separazioni altamente riproducibili del cIEF di mAbs possono essere raggiunte anche nella regione di base precedentemente problematica del gradiente di pH.