PH 4에서 10에 치료 단일 클론항체의 고해상 cIEF

치료 단백질을 성격을 나타내기 (cIEF)를 위한 모세관 등전자 집중시키 별거는 점점 최근에는 채택되었습니다. pI의 결심은 치료 단백질 준비의 신원, 순수성, 지점 번역상 수정 및 안정성 설치에 중요한 차원을 추가합니다. biopharmaceutical 기업에서 실행되는 cIEF 분석의 상당한 부분은 단일 클론항체 (mAbs)의 특성을 관련시킵니다. 많은 mAbs에는 PH 기온변화도의 기본적인 범위에 있는 pI를 가진 책임 isoforms가 있습니다. 기본적인 화합물은 구멍 PH 기온변화도를 기본적인 지구 뿐 아니라 감퇴를 한동안 함유하는 ampholytes의 부적당한 본질 때문에 cIEF에 있는 도전을 제안합니다. cIEF 견본 해결책 도움에 음극과 양극 안정제의 추가는 이 장애를 극복합니다. 게다가, 안정제 해결책 양의 최적화, 집중시키는 시간 및 양쪽성 전해질 농도는 완전한 PH 범위를 통하여 사용될 수 있는 단 하나 방법의 발달을 가능하게 합니다. 이 전략은 또한 플래트홈 방법으로 불린 제품 파이프라인 특성을 위한 단 하나 프로토콜의 발달을 가능하게 합니다. 이것은 필요 및 biopharmaceutical 기업에 있는 다양성 때문에 간단하게 중요한 점입니다. 이 노력의 결과는 운영원 오류 또는 시스템 변이에 수그린 강력한 휴대용 분석 기술의 발달 보다 적게입니다.

mAb 견본의 준비는 아래에 리스트 되는 것과 같이 실행됩니다:

• 기본적인 치료 mAb (5-10 mg/mL)의 500의 mL 양은 Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530 의 소동공, Billerica, MA)로 해빙되고 적재됩니다.
• 12의 k rcf에 Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, 캘리포니아)에 있는 5 분 동안 원심 분리 후에, 필터된 양은 20 mM Tris 버퍼 PH 8.0로 교환됩니다.
• 원심 분리와 버퍼 보충의 2개의 추가 주기는 행해지고 desalted 견본은 대략 50의 mg 조각으로 aliquoted -20 °C에 이하에 저장됩니다.

뒤에 오는 단계는 모세관과 시약에 관하여 능력을 발휘합니다:

• Beckman 풀베는 날 50 mm I.D. 중립 모세관 (p/n 477441)는 200 mm aperture로 갖춰진 모세관 카트리지에 설치됩니다.
• 임명의 앞에, 모세관은 인레트에서 탐지 Windows에 길이가 20 cm이고 출구에서 탐지 Windows에 10 cm가이고 그것의 총계 길이가 30.2 cm 이었다 그래야 측정되었습니다.
• 인산 200 mM 포함하는 Anolyte 해결책은 85% (w/v)의 550 mL를 (14.6 M) 두 배 이온을 제거된 근해의 39.5 mL를 가진 인산 (시그마 438081) 묽게 해서 40 mL 부피, (DDI) 준비되었습니다.
• 가성소다 300 mM 포함하는 Catholyte 해결책은 1개 M 가성소다 (시그마 p/n 72082)의 12 mL를 묽게 해서 근해 28 mL로 때 40 mL 부피 DDI 준비될 것입니다.
• 아세트산 350 mM 포함하는 화학 동원자 해결책은 빙하 아세트산의 0.8 mL (99.8%), DDI 근해의 39 mL로 17.4 M (시그마 p/n 537020)를 묽게 해서 때 40 mL 부피 준비될 것입니다.

도표 1. 주된 혼합 준비. cIEF 주인 혼합 해결책은 적합한 구성요소 양을 섞어서 했습니다. 이 양은 과실을 피펫으로 옮기기에 대하여 설명하기 위하여 20% 과잉 양을 포함합니다. 주된 혼합의 단 하나 부분 구성은 Pharmalyte* 3-10 (GE 헬스케어 p/n 17-0456-01)의 12 mL, L 아르기닌 500 mM의 20 mL, 200 mM IDA의 2 mL, 1.25 mM 펩티드 pI 마커의 1.0 mL, 및 3개 M ureacIEF 젤의 200 mL를 포함했습니다.

모세관 청소 해결책을 장악하기 위하여 지켜진 단계는 아래와 같이 열거됩니다:

• 모세관 청소 해결책은 DDI 근해의 30 mL에서 우레아 (시그마 p/n U0631)의 녹이는 10.8 g에 의해 대량 해결책으로 했습니다.
• 모세관 청소 해결책은 모든 고체가 5-mm 숨구멍 (Pall p/n 4199)를 가진 Acrodisc* 25 mm 주사통 필터를 통해서 녹이고 입자를 제거하기 위하여 그 후에 필터될 때까지 혼합 이었습니다.
• 3개 M 우레아 cIEF 젤 해결책은 cIEF 젤 (p/n 477497)의 9개 mL에서 우레아 (시그마 p/n U1250)의 녹이는 1.80 g에 의해 준비되고, 최소한도 15를 위해 섞이고 30 mL 주사통으로 (Becton Dickenson p/n 309650) 적재되고 5-mm 숨구멍 Acrodisc 25 mm 주사통 필터 (Pall p/n 4199)를 사용하여 입자를 제거하기 위하여 그 후에 필터되었습니다.
• 3개 M 우레아 cIEF 젤 해결책은 Allegra X를 가진 2,000 rcf에 15 R 분리기 (Beckman 풀베는 날 p/n 392933) 가스를 제거하고 2-8 °C.에 저장되었습니다.
• 500 mM Larginine 구성하고 있는 음극 안정제 해결책은 L 아르기닌 (98%) (시그마 p/n A5006)의 첫째로 녹이는 4.36 g에 의해 50 mL 부피 해 50 mL 부피 측정 플라스크에 있는 DDI 근해의 35 mL를 가진 고체, 그 후에 부피 측정 플라스크는 15 분 동안 녹이기 위하여 동요되고 DDI 근해를 가진 50 mL에 마지막으로 양을 증가시키.
• iminodiacetic 산 200 mM 포함하는 양극 안정제 해결책은 (IDA) iminodiacetic 산성의 첫째로 녹이는 1.33 g에 의해 50 mL 부피 (98%) (시그마 p/n 220000) 했습니다 50 mL 부피 측정 플라스크에 있는 근해 35 mL를 가진 고체 DDI.
• 혼합물은 15 분 동안 모든 고체를 녹이기 위하여 동요되고 양은 DDI 근해를 사용하여 50 mL에 증가시켰습니다.
• 20 mM Tris를 포함한 mAb 버퍼 보충 해결책은 DDI 근해의 6개 mL로 PH 8.0 (p/n 477427)에 50 mM Tris 버퍼의 4개 mL를 묽게 해서 했습니다.

도표 2. 견본 준비. 240 mL 주된 혼합의 따르는 섞는, desalted mAb의 약수를 포함하는 관에 추가되었습니다. 완전한 견본 해결책은 PCR 관으로 그 때, 200 mL 옮겨지고, 광유 (시그마 p/n 8410-5ML)의 단 하나 투하로 입히고 견본 작은 유리병에서 두었습니다 vortexed.

계기의 윤곽은 다음과 같이 입니다:

밟아진 조절 절차는 아래와 같이 열거됩니다:

• 모세관 카트리지의 최초 설치 후에, 중립 모세관은 첫째로 DDI 근해의 1.8 mL를 포함하고 2 Min. 동안 인레트 측에서 압력의 50 psi를 가하는 유리제 작은 유리병으로 모세관의 인레트를 물속에 넣어서 근해 행구기를 능력을 발휘해서 조절됩니다.
• 확장되는 근해 행구기는 화학 동원자의 1.8명 mL를 포함하고 2 Min. 동안 인레트 측에서 압력의 50 psi를 가하는 작은 유리병으로 모세관의 인레트를 물속에 넣어서 능력을 발휘한 약한 산성 세척에 선행됩니다.
• 마지막으로 조절 행구기는 Beckman 풀베는 날 cIEF 젤의 1.8 mL를 포함하고 5 Min. 동안 인레트 측에서 압력의 50 psi를 가하는 작은 유리병으로 모세관의 인레트를 물속에 넣어서 능력을 발휘합니다.

mAb 견본은 뒤에 오는 별거 방법을 사용하여 분리되었습니다:

• 모세관은 모세관 청소 해결책의 1.8 mL를 포함하고 3 Min. 동안 인레트 측에서 50 psi에 압력을 가하는 작은 유리병으로 모세관의 인레트를 물속에 넣어서 첫째로 정리됩니다.
• 모세관 청소 해결책 행구기 단계 뒤에 나오, 모세관은 근해로 근해 1.8 mL DDI 포함하고 2 Min. 동안 인레트 측에서 압력의 50 psi를 가하는 작은 유리병으로 모세관의 인레트를 물속에 넣어서 내뿜어집니다.
• mAb CIEF 견본 해결책은 모세관으로 모세관의 인레트 측에서 99.9 SEC를 위한 압력의 25 psi를 가해서 소개됩니다.
• 청소 도중, 근해 행구기와 견본 선적 단계는 폐기물 작은 유리병으로, 모세관의 출구 측 둡니다.
• 견본 주입 후에, 기온변화도는 catholyte의 1.8 mL를 포함하고 15 Min. 동안 모세관을 통해 25 kV 전기 잠재력을 적용하는 작은 유리병으로 anolyte의 1.8 mL를 및 모세관의 출구 측을 물속에 넣어서 포함하는 작은 유리병으로 모세관의 인레트 측 집중됩니다.
• 집중된 첨단은 catholyte 해결책이 화학 동원자의 1.8명 mL를 포함하고 20 Min. 동안 모세관을 통해 30 kV 전기 잠재력을 적용하는 작은 유리병으로 교환되는지 어느 것을 도중 화학적으로 복원됩니다.
• 동원 단계의 완료 후에, 정보 수집은 중단되고 근해 행구기 단계는 근해 1.8 mL DDI 포함하고 2 Min. 동안 인레트 측에서 압력의 50 psi를 가하는 작은 유리병으로 모세관의 인레트를 물속에 넣어서 능력을 발휘합니다.

셧다운 방법은 뒤에 오는 것 관련시킵니다:

• 계기는 차단되고 모세관은 DDI 근해의 1.8 mL를 포함하고 2 Min. 동안 인레트 측에서 압력의 50 psi를 가하는 작은 유리병으로 모세관의 인레트를 물속에 넣어서 셧다운 방법을 사용하여 작업 일의 끝에 계기에 저장됩니다 처음으로 평형시킨 모세관을.
• 근해 행구기 후에, 조절 행구기는 Beckman 풀베는 날 cIEF 젤의 1.8 mL를 포함하고 10 Min. 동안 인레트 측에서 압력의 50 psi를 가하는 작은 유리병으로 모세관의 인레트를 물속에 넣어서 능력을 발휘합니다.

숫자 1. 처음 조건.

숫자 2. 검출기 조정.

cIEF 별거 시약의 1.6 mL를 포함하는 유리제 작은 유리병은 숫자 3.에서 설명된 명령에 있는 별거 이전에 버퍼 쟁반에서 두었습니다. 모세관 청소 해결책은 요약 "모자 청결한 Sol에 의해 지정됩니다." 그리고 "Chem의 화학 동원자. 군중." 화살은 증가의 기본적인 PH 기온변화도 cIEF 별거 방법 그리고 방향에 의해 증가되는 시약을 보여줍니다.

숫자 3. 버퍼 쟁반 준비.

양쪽성 전해질에 의하여 부드럽게 된 PH를 위한 효과적인 별거 범위 그리고 선형성은 cIEF에 있는 필수적인 요인입니다. pI를 가진 합성 펩티드 마커의 위원회의 cIEF 별거는 조준해 4.1에서 10의 PH 범위를 뼘으로 재 (선형성을 평가하기 위하여 도표 3)는 기본적인 PH 범위 방법을 사용하여 능력을 발휘해. 동원 시간이 확장될 때 방법에는 넓은 기능적인 범위가 있고 산성 펩티드 마커 분리 가능하다는 것을 조차 이 별거 (FIG. 4)는 보여줍니다.

도표 3. pI 마커 감지 시간. 숫자 4.에 있는 pI 마커 별거를 위한 pI 점, 아미노산 서열 및 감지 시간을 포함합니다.

숫자 4. 합성 펩티드 pI 마커의 cIEF 별거. 그것은 기본적인 PH 기온변화도 cIEF 별거 방법을 사용하여 7개의 합성 펩티드 마커의 electropherogram를 포함합니다. 동원 단계는 35에서 40 분에 확장되었습니다 pI 4.1 마커의 탐지를 가능하게 하기 위하여.

기온변화도가 0.99의 상호 관계 계수를 가진 PH 10와 4.1 사이 선형 이다는 것을 pI의 분석 대 감지 시간 (합성 펩티드 마커를 위한 FIG. 5)는 보여줍니다. 제대로 집중된 높게 기본적인 단백질 종은 소금 전선으로 때때로 틀립니다. 이것은 음극 전 첨단으로 숫자 4에서 보입니다.

숫자 5. pI 마커 선형 모형. pI 가치의 작의 대 도표 1.에서 요약된 것처럼 합성 펩티드의 별거를 위해 관찰되는 감지 시간. pI 마커의 동원은 복원한 PH 기온변화도가 높게 선형 이다는 것을 표시하는 0.99의 상호 관계 계수와 선형 모형을 맞습니다.

mAbs는 cIEF로 분리될 때 복잡한 책임 isoform 단면도를 생성해 경향이 있습니다. 첨단을 위한 실제적인 pI 가치 이외에 이 단면도는 "mAb" 지문을 생성합니다. 이런 이유로 cIEF가 분리되는 mAb 준비의 식별 그리고 특성에 있는 강력한 공구일 수 있다 입니다. 다른 mAbs를 위한 유일한 피크 단면도는 넓은 PH 3에서 10를 사용하여 단 하나 방법이 양쪽성 전해질 혼합물 기온변화도 (FIG. 6)의 기본적인 범위를 통해 1개의 PH 부대의 약간 백번째까지 pI에 있는 다름 해결 가능하다는 것을 보여줍니다.

숫자 6. 3 기본적인 mAb's의 cIEF 별거. 3개의 기본적인 mAbs를 위한 Electropherograms는 숫자 4.에서 보이는 것처럼 동일 조건을 사용하여 cIEF로 분리했습니다.

이 방법을 위해 중간 정밀도를 시험하기 위하여는, 3개의 항체의 위원회는 중립 모세관의 2개의 다른 제비를 사용하여 2개의 계기 및 6 분리되는 일에 시약에 분리되었습니다. 모든 데이터는 32 KaratTM 소프트웨어를 사용하여 통합 이었습니다. pI는 pI 10와 7 합성 펩티드 마커의 감지 시간을 사용하여 정성 분석 공구를 통해서 결의가 굳었습니다. 첨단은 각 mAb를 위한 3개의 isoform 단의 한으로, 기본, 주요 산성 분류되고, 퍼센트 구성은 각 isoform 단 (Figs. 7-9)를 위해 산출되었습니다. 7개의 서명 첨단의 pI 점 및 시험된 3개의 mAbs의 각각을 위한 3개의 isoform 단의 퍼센트 구성은 기록되었습니다. 이 기록된 가치는 그 때 분석실험 재현성을 측정하기 위하여 이용된 변동 계수 (%CV) 퍼센트 산출하기 위하여 이용되었습니다.

숫자 7. mAb (1) 피크 단면도. mAb #1 cIEF 별거의 전망 높은 쪽으로 마지막.

mAb #1 cIEF 별거의 도표 4. 정량 분석. 정량 분석은 7개의 서명 첨단의 pI 점 및 3개의 isoform 단의 퍼센트 구성을 사용하여 능력을 발휘했습니다.

숫자 8. mAb #2 첨단 단면도. mAb #2 cIEF 별거의 전망 높은 쪽으로 마지막.

mAb #2. 정량 분석의 도표 5. 정량 분석은 mAb #1.와 동일 방법을 사용하여 능력을 발휘했습니다.

숫자 9. mAb #3 첨단 단면도. mAb #3 cIEF 별거의 전망 높은 쪽으로 마지막.

mAb #3. 정량 분석의 도표 6. 정량 분석은 mAb #1.와 동일 방법을 사용하여 능력을 발휘했습니다.

단 하나 별거 방법은 넓은 PH 범위를 통해 다중 mAbs의 cIEF 분석을 능력을 발휘하기 위하여 채택될 수 있습니다. 단 하나 방법의 사용은 과실과 간 견본 ariability를 피펫으로 옮기는 감소시키는 것을 도울 수 있는 주된 별거 혼합 준비 가능하게 합니다. 워크 플로우는 기회를 감소시키고 방법 발달에 있는 전반적인 효율성을 증가하는 운영원 오류를 위해 플래트홈 방법을 사용해서 간단하게 합니다. cIEF 분리 기술의 분석적인 힘은 각 mAb 별거에서 일어난 3개의 아주 다른 피크 단면도에 의해 설명됩니다. 별거 방법의 재현성은 시약의 다중 제비를 가진 다중 계기를 사용하여 6 분리되는 일에 일련의 별거를 수행해서 설명되었습니다. pI와 isoform 단 퍼센트 구성의 통계 분석은 mAbs의 높게 재생 가능한 cIEF 별거가 PH 기온변화도의 이전에 문제적인 기본적인 지구에서 조차 달성될 수 있다는 것을 확인합니다.