治療單克抗體高分辨率 cIEF 從酸碱度 4 的到 10

分析的治療 (cIEF)蛋白質血絲等電子聚焦分隔近年來越來越採用。pI 的確定添加重要維數到設立身分、純度、之後平移治療蛋白質準備的修改和穩定性。 cIEF 分析的一個重要比例在這個 biopharmaceutical 行業被執行的介入單克抗體 (mAbs) 的描述特性。 許多 mAbs 有與 pI 的充電 isoforms 在酸碱度梯度的基本的範圍。 基本的化合物提供在 cIEF 的一個挑戰由於隨著時間的推移包括基本的區域以及朽爛的 ampholytes 的不適於的本質漏洞酸碱度梯度。 負極和正極安定器的添加對 cIEF 範例解決方法幫助的克服這些阻礙。 另外，安定器解決方法數量的優化，集中的時代和兩性電解物含量啟用可以使用在完全酸碱度範圍中一個唯一方法的發展。 此方法啟用一個唯一協議的發展產品也指平臺方法傳遞途徑描述特性的。 這簡而言之是重點由於在這個 biopharmaceutical 行業的需要和通用性。 這些工作成績的結果是一個穩健和可移植的分析技術的發展較不傾向對操作員錯誤或系統差異。

mAb 範例的準備進行如下所示：

• 基本的治療 mAb (5-10 mg/mL) 的一個 500 個 mL 數量被解凍并且被裝載到 Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530，微孔， Billerica， MA)。
• 在 5 分鐘的離心法以後在 12 个 k rcf 的 Microfuge 18 (p/n 367160， Beckman Coulter， Inc.， Fullerton，加州)，這個被過濾的數量用 20 mM Tris 緩衝酸碱度 8.0 替換。
• 離心法和緩衝替換的二個另外的循環完成，并且這個脫鹽的範例 aliquoted 到大約 50 個 mg 分數并且存儲在 -20 °C 以下。

下列步驟執行關於血絲和試劑：

• Beckman 犁刀 50 mm i.d。 中立血絲 (p/n 477441) 在用 200 mm aperture 裝備的一個血絲子彈被安裝。
• 在安裝前，血絲被評定了，以便其總長度是 30.2 cm，并且長度從入口到檢測視窗是 20 cm，并且從出口到檢測視窗是 10 cm。
• 包含 200 mM 的 Anolyte 解決方法磷酸通過稀釋 550 mL 準備， 40 mL 批量項目貨簽， 85% (w/v) (14.6 M) 磷酸 (斯格碼 438081) 與 39.5 mL 二重被去離子的 (DDI)水。
• 包含 300 mM 的陰極電解液解決方法氫氧化鈉通過稀釋 12 mL 準備，當 40 mL 批量項目貨簽 1 M 氫氧化鈉 (斯格碼 p/n 72082) 到 28 mL DDI 水。
• 包含 350 mM 的化工運動員解決方法乙酸通過稀釋 0.8 mL 準備，當 40 mL 批量項目貨簽冰河乙酸 (99.8%)， 17.4 M (斯格碼 p/n 537020) 到 39 mL DDI 水裡。

表 1. 主要混合準備。 cIEF 重要資料混合解決方法通過混合適當的組件數量做。 這些數量包括一個 20% 過剩數量佔吸取錯誤。 唯一部分結構的主要混合包含了 12 mL Pharmalyte* 3-10 (GE 醫療保健 p/n 17-0456-01)， 500 mM 20 mL L 氨基胍基戊酸， 200 mM IDA 2 mL， 1.25 mM 肽 pI 標記 1.0 mL 和 3 M ureacIEF 膠凝體 200 mL。

按照的步驟獲得血絲清潔解決方法如下是列出的：

• 血絲清潔解決方法做作為一個批量解決方法由溶化的 10.8 g 尿素 (斯格碼 p/n U0631) 在 30 mL DDI 水。
• 血絲清潔解決方法是混雜的，直到所有固體溶化了和然後過濾有 5-mm 毛孔的 (遮蓋物 p/n 4199) Acrodisc* 25 mm 注射器補白去除微粒。
• 一個 3 M 尿素cIEF 膠凝體解決方法由溶化的 1.80 g 尿素準備 (斯格碼 p/n U1250) 在 9 mL cIEF 膠凝體 (p/n 477497)，為 15 混合最小并且被裝載了到 30 ml 注射器 (Becton Dickenson p/n 309650) 然後被過濾使用 5-mm 毛孔 Acrodisc 25 mm 注射器補白 (遮蓋物 p/n 4199) 去除微粒。
• 3 M 尿素cIEF 膠凝體解決方法去除了毒氣在 2,000 與 Allegra X 的 rcf 15 R 離心機 (Beckman 犁刀 p/n 392933) 并且存儲了在 2-8 个 °C。
• 包括 500 mM Larginine 的負極安定器解決方法由首先溶化的 4.36 g 做， 50 mL 批量項目貨簽 L 氨基胍基戊酸 (98%) (斯格碼 p/n A5006) 與 35 mL 的固體在一個 50 mL 容量瓶的 DDI 水，然後容量瓶被震動在 15 分鐘溶化和終於增加這個數量對 50 mL 用 DDI 水。
• 包含 200 mM 的正極安定器解決方法 iminodiacetic 酸 (IDA)由首先溶化的 1.33 g iminodiacetic 酸做， 50 mL 批量項目貨簽 (98%) (斯格碼 p/n 220000) 與 35 mL 的固體在一個 50 mL 容量瓶的 DDI 水。
• 這個混合物被震動在 15 分鐘溶化所有固體使用 DDI 水，并且這個數量增加到 50 mL。
• 包含 20 mM Tris 的 mAb 緩衝替換解決方法通過稀釋 4 mL 做在酸碱度 8.0 (p/n 477427) 的 50 mM Tris 緩衝用 6 mL DDI 水。

表 2. 範例準備。 按照的混合 240 mL 主要混合，被添加了到包含整除數脫鹽的 mAb 的管。 完全範例解決方法然後 vortexed， 200 mL 調用了到 PCR 管，用唯一下落礦物油覆蓋了 (斯格碼 p/n 8410-5ML) 并且安置了在範例小瓶。

儀器的配置是如下：

被仿效的這種適應的做法如下是列出的：

• 在這個血絲子彈的最初安裝以後，中立血絲通過首先進行水漂洗適應通過淹沒血絲的入口到包含 1.8 mL DDI 水和施加 50 psi 壓的一個玻璃小瓶從入口端 2 Min。
• 延長的水漂洗由弱跟隨酸沖洗執行通過淹沒血絲的入口到包含 1.8 mL 化工運動員和施加 50 psi 壓的小瓶從入口端 2 Min。
• 最終適應的沖洗通過淹沒血絲的入口執行到包含 1.8 mL Beckman 犁刀 cIEF 膠凝體和施加 50 psi 壓的小瓶從入口端 5 Min。

使用下列分隔方法， mAb 範例分隔：

• 血絲被淹沒血絲的入口首先清洗到包含 1.8 mL 血絲清潔解決方法和施加在 50 psi 的小瓶壓從入口端 3 Min。
• 從事血絲清潔解決方法沖洗步驟，血絲注滿以水被淹沒血絲的入口到包含 1.8 mL DDI 水和施加 50 psi 壓的小瓶從入口端 2 Min。
• mAb CIEF 範例解決方法被引入到血絲被施加 25 psi 壓為 99.9 秒數從血絲的入口端。
• 在清潔期間，水漂洗和範例裝載步驟，血絲的出口側被安置到一個廢小瓶。
• 在範例射入以後，這個梯度通過淹沒血絲的入口端到包含 1.8 mL anolyte 的小瓶和血絲的出口側集中到包含 1.8 mL 陰極電解液和適用在血絲間的小瓶 25 kV 電子潛在 15 Min。
• 集中的峰頂被動員化工在哪些期間這個陰極電解液解決方法用包含 1.8 mL 化工運動員和適用在血絲間的小瓶替換 30 kV 電子潛在 20 Min。
• 在完成動員步驟後，數據收集被終止，并且水漂洗步驟通過淹沒血絲的入口執行到包含 1.8 mL DDI 水和施加 50 psi 壓的小瓶從入口端 2 Min。

關閉方法介入以下：

• 儀器被關閉，并且血絲在儀器存儲在工作日結束時使用通過淹沒血絲入口首先平均血絲到包含 1.8 mL DDI 水和施加 50 psi 壓的小瓶從入口端 2 Min. 的關閉方法。
• 在水漂洗以後，適應的沖洗通過淹沒血絲的入口執行到包含 1.8 mL Beckman 犁刀 cIEF 膠凝體和施加 50 psi 壓的小瓶從入口端 10 Min。

圖 1. 最初的情況。

圖 2. 探測器設置。

包含 1.6 mL cIEF 分隔試劑的玻璃小瓶在緩衝盤安置了在分隔之前按在表說明的順序 3。 血絲清潔解決方法是由縮寫 「蓋帽乾淨的 Sol 選定的」。 并且化工運動員 「Chem。 暴民」。 箭頭顯示由基本的酸碱度梯度 cIEF 分隔方法和增加的方向增加的試劑。

圖 3. 緩衝盤設置。

有效分隔範圍和線性兩性電解物緩衝的酸碱度的是重要系數在 cIEF。 綜合肽標記面板的 cIEF 分隔與 pI 的指向跨過酸碱度範圍的 4.1 到 10 (表 3) 執行使用基本的酸碱度範圍方法估計線性。 此分隔 (圖 4) 向顯示這個方法有一個寬功能範圍并且甚而能够分隔酸性肽標記，當動員時間是延長的。

表 3. pI 標記檢測時間。 在表 4. 包含 pI 點、氨基酸順序和檢測時間的 pI 標記分隔。

圖 4. 綜合肽 pI 標記 cIEF 分隔。 使用基本的酸碱度梯度 cIEF 分隔方法，它包含七個綜合肽標記電泳圖譜。 動員步驟從 35 是延長的到 40 分鐘啟用 pI 4.1 標記的檢測。

對 pI 的分析與檢測時間 (綜合肽標記的圖 5) 向顯示這個梯度是線性的在與相關系數的酸碱度 10 和 4.1 之間 0.99。 高度不適當地集中的基本的蛋白質種類有時弄錯作為鹽前線。 這在表 4 顯示作為負極前峰頂。

圖 5. pI 標記線性模型。 pI 值劇情與對綜合肽的分隔觀察的檢測時間如總結表 1。 pI 標記的動員符合一個線性模型表明的相關系數 0.99 被動員的酸碱度梯度是高度線性的。

mAbs 傾向於生成複雜充電 isoform 配置文件，當分隔由 cIEF。 除實際 pI 值之外的這些配置文件峰頂的生成一個 「mAb」指紋。 為此是 cIEF 可以是在單獨 mAb 準備的確定和描述特性的一個強大的工具。 不同的 mAbs 的唯一高峰配置文件向顯示使用清楚的 PH3 的一個唯一方法對 10 兩性電解物混合物能够解決在 pI 上的區別至 1 個酸碱度部件一些百在這個梯度間 (圖 6) 的基本的範圍的。

圖 6. 三个基本的 mAb's cIEF 分隔。 如圖 4. 所顯示，三基本的 mAbs 的電泳圖譜由 cIEF 分隔使用同樣條件。

為了為此方法測試半成品精確度，三抗體面板在二臺在六不同日的儀器使用二不同許多中立血絲和試劑分隔。 所有數據使用 32 KaratTM 軟件是集成。 pI 通過定性分析工具是確定的使用 pI 10 和 7 綜合肽標記的檢測時間。 峰頂被編組了到每个 mAb 的三個 isoform 組之一，基本，主要和酸性，并且百分比構成為每個 isoform 組 (Figs. 被計算了 7-9)。 pI 點七個簽名峰頂和百分比結構的被測試的三 mAbs 中的每一的三個 isoform 組被記錄了。 這些記錄的值然後用於計算用於衡量檢驗增殖率的百分比變化參數 (%CV)。

圖 7. mAb (1) 高峰配置文件。 mAb #1 cIEF 分隔的視圖的關閉。

對 mAb #1 cIEF 分隔的表 4. 定量分析。 使用 pI 點七個簽名峰頂和百分比結構的三個 isoform 組，定量分析執行。

圖 8. mAb #2 峰頂配置文件。 mAb #2 cIEF 分隔的視圖的關閉。

對 mAb #2. 定量分析的表 5. 定量分析執行使用方法和 mAb #1. 一樣。

圖 9. mAb #3 峰頂配置文件。 mAb #3 cIEF 分隔的視圖的關閉。

對 mAb #3. 定量分析的表 6. 定量分析執行使用方法和 mAb #1. 一樣。

一個唯一分隔方法可以被使用執行對在一個清楚的酸碱度範圍間的多個 mAbs 的 cIEF 分析。 使用一個唯一方法啟用準備可能幫助減少吸取錯誤和相互範例 ariability 的主要分隔混合。 通過使用平臺方法，工作流簡化，減少操作員錯誤的機會和增加在方法發展的綜合效率。 cIEF 分離技術的分析功率是由在每 mAb 分隔導致的三個非常不同的高峰配置文件說明的。 分隔方法的增殖率通過執行在六不同日的一系列的分隔展示使用有多個許多的多個儀器試劑。 對 pI 和 isoform 組百分比構成的統計分析確認高度 mAbs 的再現 cIEF 分隔甚而在酸碱度梯度的以前有問題的基本的區域可以達到。