CIEF De alta resolución de Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos de pH 4 a 10

La separación Capilar de la concentración (cIEF) isoeléctrica para caracterizar las proteínas terapéuticas se ha adoptado cada vez más estos últimos años. La determinación del pi agrega una dimensión crítica a establecer identidad, pureza, la modificación poste-de translación y la estabilidad de las preparaciones terapéuticas de la proteína. Una proporción importante de análisis del cIEF que son realizados en la industria biopharmaceutical implica la caracterización de los anticuerpos monoclonales (mAbs). Muchos mAbs tienen isoforms de la carga con un pi en el rango básico del gradiente del pH. Las pastas Básicas ofrecen un reto en el cIEF debido a la naturaleza inadecuada de los ampholytes que comprenden la región así como la extinción básicas del gradiente del agujero pH en un cierto plazo. La Adición de estabilizadores catódicos y anódicos a las ayudas de la solución de la muestra del cIEF supera estos obstáculos. Además, la optimización de los volúmenes de la solución del estabilizador, los tiempos de enfoque, y la concentración del anfólito activa el revelado de un único método que se pueda utilizar en el rango completo del pH. Esta estrategia activa el revelado de un único protocolo para la caracterización de la tubería del producto también designada un método de la plataforma. Esto es un aspecto importante debido a la necesidad de la simplicidad y de la flexibilidad en la industria biopharmaceutical. El resultado de estos esfuerzos es el revelado de una variación robusta y portátil del desvío o del sistema de operador menos propenso analítico de la técnica.

La preparación de las muestras del mAb se realiza según lo enlistado abajo:

• Los 500 volúmenes del mL de un mAb terapéutico básico (5-10 mg/ml) se descongelan y se cargan en un Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530, Millipore, Billerica, MA).
• Después de la centrifugación para el minuto 5 en un Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) en el rcf de 12 k, el volumen filtrado se reemplaza por el almacenador intermediaro pH 8,0 de 20 milímetros Tris.
• Dos ciclos adicionales del repuesto de la centrifugación y del almacenador intermediaro se hacen y la muestra desalada aliquoted en aproximadamente 50 fracciones del mg y se salva en el °C -20 o abajo.

Los pasos de progresión siguientes se realizan en cuanto a capilares y a reactivos:

• Una identificación del mm de la Cuchilla 50 de Beckman. El Capilar Neutral (p/n 477441) se instala en un Cartucho Capilar equipado de 200 aperture del milímetro.
• Antes de la instalación, el capilar fue medido de modo que su longitud total fuera 30,2 cm y la longitud de la entrada a la ventana de la detección fuera 20 cm y del enchufe a la ventana de la detección fueran 10 cm.
• Las soluciones de Anolyte que contenían 200 milímetros de ácido fosfórico fueron preparadas como un bulto de 40 ml, diluyendo 550 ml del 85% (peso/volumen) (M) 14,6 ácido fosfórico (Sigma 438081) con 39,5 ml de agua (DDI) doble-desionizada.
• Las soluciones Católitas que contenían 300 milímetros de hidróxido de sodio fueron preparadas mientras que un bulto de 40 ml diluyendo 12 ml de hidróxido de sodio de 1 M (Sigma p/n 72082) en 28 ml de agua de DDI.
• Las soluciones Químicas del movilizador que contenían 350 milímetros de ácido acético fueron preparadas mientras que un bulto de 40 ml diluyendo 0,8 ml de ácido acético glacial (99,8%), 17,4 M (Sigma p/n 537020) en 39 ml de agua de DDI.

Preparación Principal de la Mezcla del Cuadro 1. Una solución de la mezcla del capitán del cIEF fue hecha mezclando los volúmenes componentes apropiados. Estos volúmenes incluyen un volumen del excedente de mercancías del 20% para explicar medir con una pipeta desvío. La única composición de la porción de la mezcla principal contuvo 12 mL de Pharmalyte* 3-10 (Atención Sanitaria p/n 17-0456-01 de GE), 20 mL de 500 milímetros de L-Arginina, 2 mL de 200 milímetros IDA, 1,0 mL de las etiquetas de plástico del péptido pi de 1,25 milímetros, y 200 mL del Gel del ureacIEF de 3M.

Los pasos de progresión seguidos para obtener la solución capilar de la limpieza son mencionados abajo:

• La solución Capilar de la limpieza fue hecha como solución a granel por g de disolución 10,8 de la urea (Sigma p/n U0631) en 30 ml de agua de DDI.
• La solución Capilar de la limpieza era mezclada hasta que todos los macizo disolvieran y después fueran filtrados con un Acrodisc* filtro de la jeringa de 25 milímetros con un poro del 5-mm (Paño Mortuorio p/n 4199) para quitar partículas.
• Una solución del gel de la urea-cIEF de 3M fue preparada por g de disolución 1,80 de la urea (Sigma p/n U1250) en 9 ml del gel del cIEF (p/n 477497), mezclada para 15 mínimos y cargada en una jeringa 30-mL (Becton Dickenson p/n 309650) y después filtrada usando un poro Acrodisc del 5-mm el filtro de la jeringa de 25 milímetros (Paño Mortuorio p/n 4199) para quitar partículas.
• La solución del gel de la urea-cIEF de 3M fue desgasificada en el rcf 2.000 con un Allegra X centrifugadora de 15 R (Cuchilla p/n 392933 de Beckman) y salvada en 2-8 °C.
• La solución Catódica del estabilizador que comprendía 500 milímetros Larginine fue hecha como un bulto de 50 ml por 4,36 primero de disolución g de la L-Arginina (el 98%) (Sigma p/n A5006) macizo con 35 ml de agua de DDI en un matraz volumétrico de 50 ml, después el matraz volumétrico fue sacudido para que el minuto 15 disuelva y finalmente aumentando el volumen a 50 ml con agua de DDI.
• La solución Anódica del estabilizador que contenía 200 milímetros de ácido iminodiacetic (IDA) fue hecha como un bulto de 50 ml por g primero de disolución 1,33 de ácido iminodiacetic (el 98%) (Sigma p/n 220000) macizo con 35 ml de agua de DDI en un matraz volumétrico de 50 ml.
• La mezcla fue sacudida para que el minuto 15 disuelva todos los macizo y el volumen fue aumentado a 50 ml usando el agua de DDI.
• La solución del repuesto del almacenador intermediaro del mAb que contuvo 20 milímetros Tris fue hecha diluyendo 4 ml de almacenador intermediaro de 50 milímetros Tris en pH 8,0 (p/n 477427) con 6 ml de agua de DDI.

Preparación de la Muestra del Cuadro 2. Mezcla de Siguiente de la mezcla principal del mL 240, fue agregado a un tubo que contenía una parte alícuota de mAb desalado. La solución completa de la muestra entonces vortexed, 200 mL fue transferida en un tubo de la POLIMERIZACIÓN EN CADENA, sobrepuesta con una única caída del aceite mineral (Sigma p/n 8410-5ML) y colocada en un frasco de la muestra.

La configuración del instrumento es como sigue:

El procedimiento de condicionamiento seguido es mencionado abajo:

• Después de la instalación inicial del cartucho capilar, el capilar neutral es condicionado primero realizando una aclaración de agua sumergiendo la entrada del capilar en un frasco de cristal que contiene 1,8 ml de agua de DDI y que aplica de 50 PSI una presión de la cara de la entrada por 2 Min.
• La aclaración de agua extendida es seguida por una estela turbulenta ácida débil realizada sumergiendo la entrada del capilar en un frasco que contiene a 1,8 ml de movilizador químico y que aplica de 50 PSI una presión de la cara de la entrada por 2 Min.
• Finalmente una aclaración de condicionamiento es realizada sumergiendo la entrada del capilar en un frasco que contiene 1,8 ml de gel del cIEF de la Cuchilla de Beckman y que aplica de 50 PSI una presión de la cara de la entrada por 5 Min.

Las muestras del mAb fueron separadas usando el método de separación siguiente:

• El capilar primero es limpiado sumergiendo la entrada del capilar en un frasco que contiene 1,8 ml de solución capilar de la limpieza y que aplica la presión en 50 PSI de la cara de la entrada por 3 Min.
• Después del paso de progresión capilar de la aclaración de la solución de la limpieza, el capilar es vaciado con agua sumergiendo la entrada del capilar en un frasco que contiene 1,8 ml de agua de DDI y que aplica de 50 PSI una presión de la cara de la entrada por 2 Min.
• La solución de la muestra del mAb CIEF es introducida en el capilar aplicando de 25 PSI una presión para el sec 99,9 de la cara de la entrada del capilar.
• Durante la limpieza, los pasos de progresión del cargamento de la aclaración de agua y de la muestra, la cara de enchufe del capilar se ponen en un frasco inútil.
• Después de la inyección de la muestra, el gradiente es enfocado sumergiendo la cara de la entrada del capilar en un frasco que contiene 1,8 ml de anolyte y la cara de enchufe del capilar en un frasco que contiene 1,8 ml de católito y que aplica un potencial eléctrico de 25 kilovoltios a través del capilar por 15 Min.
• Los picos enfocados se movilizan químicamente durante cuál se reemplaza la solución católita por un frasco que contiene a 1,8 ml de movilizador químico y que aplica un potencial eléctrico de 30 kilovoltios a través del capilar por 20 Min.
• Tras completar el paso de progresión de la movilización, se para la colección de datos y un paso de progresión de la aclaración de agua es realizado sumergiendo la entrada del capilar en un frasco que contiene 1,8 ml de agua de DDI y que aplica de 50 PSI una presión de la cara de la entrada por 2 Min.

El método de la parada normal implica el siguiente:

• Se cierra el instrumento y el capilar se salva en el instrumento en el final del día laborable usando un método de la parada normal que primero equilibró el capilar sumergiendo la entrada del capilar en un frasco que contenía 1,8 ml de agua de DDI y que aplicaba de 50 PSI una presión de la cara de la entrada por 2 Min.
• Después de la aclaración de agua, una aclaración de condicionamiento es realizada sumergiendo la entrada del capilar en un frasco que contiene 1,8 ml de gel del cIEF de la Cuchilla de Beckman y que aplica de 50 PSI una presión de la cara de la entrada por 10 Min.

Cuadro 1. Condiciones Iniciales.

Cuadro 2. Configuraciones del Detector.

Los frascos De Cristal que contenían 1,6 ml de reactivos de la separación del cIEF fueron colocados en las bandejas del almacenador intermediaro antes de la separación en la orden ilustrada en el Cuadro 3. La solución capilar de la limpieza es señalada por la abreviatura “Solenoide Limpio del Casquillo.” y movilizador químico de “Chem. Mob.” Las Flechas muestran los reactivos que son incrementados por el Método de Separación Básico del cIEF del Gradiente del pH y la dirección del incremento.

Cuadro 3. Ajuste de la Bandeja del Almacenador Intermediaro.

El rango y las linearidades efectivos de la separación para el pH protegido anfólito son factores esenciales en cIEF. Las separaciones del cIEF de un panel de las etiquetas de plástico sintetizadas del péptido con el pi apuntan atravesando el rango del pH de 4,1 a 10 (el Cuadro 3) fue realizado usando el método básico del rango del pH para evaluar linearidades. Esta separación (la Fig. 4) muestra que el método tiene un rango funcional ancho y es incluso capaz de separar las etiquetas de plástico ácidas del péptido cuando el tiempo de movilización es extendido.

Tiempos de Detección de la Etiqueta De Plástico del Cuadro 3. pi. Contiene las puntas del pi, las series de aminoácido y los tiempos de detección para la separación de las etiquetas de plástico del pi en el Cuadro 4.

Cuadro 4. Separaciones del cIEF de las Etiquetas De Plástico Sintetizadas del Péptido pi. Contiene un electroferograma de siete etiquetas de plástico sintetizadas del péptido usando el método de separación básico del cIEF del gradiente del pH. El paso de progresión de la movilización era extendido a partir del 35 a 40 minutos activar la detección de la etiqueta de plástico del pi 4,1.

Análisis del pi comparado con tiempo de detección (la Fig. 5) para las etiquetas de plástico sintetizadas del péptido muestra que el gradiente es lineal entre pH 10 y 4,1 con un coeficiente de correlación de 0,99. Las especies Altamente básicas de la proteína enfocadas no correctamente están confundidas a veces como partes de la sal. Esto se muestra en el Cuadro 4 como los pre-picos catódicos.

Cuadro 5. Modelo Lineal de la Etiqueta De Plástico del pi. Un gráfico de los valores del pi comparado con el tiempo de detección observado para la separación de péptidos sintetizados como se resume en el Cuadro 1. La movilización de las etiquetas de plástico del pi ajusta un modelo lineal con un coeficiente de correlación de 0,99 que indica que el gradiente movilizado del pH es altamente lineal.

los mAbs tienden a generar perfiles complejos del isoform de la carga cuando son separados por el cIEF. Estos perfiles además de los valores reales del pi para los picos generan una huella dactilar del “mAb”. Es por esta razón que el cIEF puede ser una herramienta potente en la identificación y la caracterización de las preparaciones separadas del mAb. El perfil máximo único para diversos mAbs muestra que un único método usando un PH3 amplio a la mezcla del anfólito 10 es capaz de resolver diferencias en el pi hasta algunos centésimo de 1 unidad del pH a través del rango básico del gradiente (Fig. 6).

Cuadro 6. Separaciones del cIEF de Tres mAb Básicos. Los Electroferogramas para tres mAbs básicos se separaron por el cIEF usando las mismas condiciones tal y como se muestra en del Cuadro 4.

Para probar la precisión intermedia para este método, un panel de tres anticuerpos fue separado en dos instrumentos usando dos diversos lotes del capilar neutral y reactivos en seis días separados. Todos Los datos eran integrados usando el software de 32 KaratTM. el pi era resuelto a través de la herramienta de análisis cualitativo usando los tiempos de detección de las etiquetas de plástico sintetizadas del péptido del pi 10 y 7. Los picos fueron agrupados en uno de tres grupos del isoform para cada mAb, básico, principal y ácido, y una composición del por ciento era calculada para cada grupo del isoform (Figs. 7-9). La punta del pi de siete picos de la firma y la composición del por ciento de tres grupos del isoform para cada uno de los tres mAbs probados fueron registradas. Estos valores registrados entonces fueron utilizados para calcular los coeficientes del por ciento de variación (%CV) que fueron utilizados para calibrar reproductibilidad del análisis.

Cuadro 7. Perfil Máximo del mAb (1). Un cierre encima de la vista de la separación del cIEF del mAb #1.

Análisis Cuantitativo del Cuadro 4. de la Separación del cIEF del mAb #1. El análisis Cuantitativo fue realizado usando la punta del pi de siete picos de la firma y la composición del por ciento de tres grupos del isoform.

Cuadro 8. Perfil del Pico del mAb #2. Un cierre encima de la vista de una separación del cIEF del mAb #2.

El Análisis Cuantitativo del Cuadro 5. del análisis Cuantitativo del mAb #2. fue realizado usando el mismo método que mAb #1.

Cuadro 9. Perfil del Pico del mAb #3. Un cierre encima de la vista de una separación del cIEF del mAb #3.

El Análisis Cuantitativo del Cuadro 6. del análisis Cuantitativo del mAb #3. fue realizado usando el mismo método que mAb #1.

Un único método de separación se puede emplear para realizar el análisis del cIEF de mAbs múltiples a través de un rango amplio del pH. El uso de un único método activa la preparación de las mezclas principales de la separación que pueden ayudar a reducir el medir con una pipeta de desvíos y de ariability de la inter-muestra. El Flujo De Trabajo se simplifica usando un método de la plataforma, reduciendo las ocasiones para el desvío de operador y aumentando eficiencia total en el revelado del método. La potencia analítica de la técnica de separación del cIEF es ilustrada por los tres perfiles máximos muy diversos producidos en cada separación del mAb. La reproductibilidad del método de separación fue demostrada conducto una serie de separaciones en seis días separados usando los instrumentos múltiples con los lotes múltiples de reactivos. El análisis Estadístico de la composición del por ciento del grupo del pi y del isoform confirma que las separaciones altamente reproductivas del cIEF de mAbs se pueden lograr incluso en la región básica previamente problemática del gradiente del pH.