CIEF De haute résolution des Anticorps Monoclonaux Thérapeutiques de pH 4 à 10

La séparation Capillaire de mise au point (cIEF) isoélectrique pour caractériser les protéines thérapeutiques a été de plus en plus adoptée ces dernières années. La détermination de pi ajoute une cote critique à déterminer l'identité, la pureté, la modification poteau-de translation et la stabilité des préparations thérapeutiques de protéine. Une part importante d'analyses de cIEF étant effectuées dans l'industrie biopharmaceutical concernent la caractérisation des anticorps monoclonaux (mAbs). Beaucoup de mAbs ont des isoforms de charge avec pi dans le domaine de base du gradient de pH. Les composés De base offrent un défi dans le cIEF dû à la nature inadéquate des ampholytes comportant la région ainsi que le délabrement de base du gradient du trou pH au fil du temps. L'Ajout des stabilisateurs cathodiques et anodiques aux aides de solution témoin de cIEF surmontent ces obstacles. Supplémentaire, l'optimisation des volumes de solution de stabilisateur, les temps s'orientants, et la concentration en ampholyte active l'élaboration d'une méthode unique qui peut être utilisée dans tout le domaine complet de pH. Cette stratégie active le développement d'un protocole unique pour la caractérisation de pipeline de produit également désignée sous le nom d'une méthode de plate-forme. C'est un aspect important dû au besoin de simplicité et de souplesse dans l'industrie biopharmaceutical. Le résultat des efforts est le développement d'une variation robuste et portative des erreurs ou de système de téléphoniste moins enclines analytiques de technique.

La préparation des échantillons de mAb est exécutée comme indiqué ci-dessous :

• Des 500 volumes de mL d'un mAb (5-10 mg/ml) thérapeutique de base sont dégelés et chargés dans un Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530, Millipore, Billerica, MAMANS).
• Après centrifugation pour mn 5 dans un Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) au rcf de 12 k, le volume filtré est remplacé par le tampon pH 8,0 de 20 millimètres Tris.
• Deux cycles supplémentaires de remontage de centrifugation et de tampon est faits et l'échantillon dessalé aliquoted dans approximativement 50 fractions de mg et est enregistré au °C -20 ou ci-dessous.

Les phases suivantes sont exécutées en ce qui concerne des capillaires et des réactifs :

• Une identification de mm du Coutre 50 de Beckman. Le Capillaire Neutre (p/n 477441) est installé dans une Cartouche Capillaire équipée des 200 aperture de millimètre.
• Avant installation, le capillaire a été mesuré de sorte que sa longueur totale ait été le cm 30,2 et la longueur de la prise à l'hublot de dépistage ait été le cm 20 et de la prise à l'hublot de dépistage ait été le cm 10.
• Des solutions d'Anolyte contenant 200 millimètres d'acide phosphorique ont été préparées comme un volume de 40 ml, en diluant 550 ml de 85% (poids/volume) (M) 14,6 acide phosphorique (Sigma 438081) avec 39,5 ml de l'eau (DDI) double-désionisée.
• Des solutions Catholyte contenant 300 millimètres d'hydroxyde de sodium ont été préparées pendant qu'un volume de 40 ml en diluant 12 ml d'hydroxyde de sodium de 1 M (Sigma p/n 72082) dans 28 ml d'eau de DDI.
• Des solutions Chimiques de mobilisateur contenant 350 millimètres d'acide acétique ont été préparées pendant qu'un volume de 40 ml en diluant 0,8 ml d'acide acétique glaciaire (99,8%), 17,4 M (Sigma p/n 537020) dans 39 ml de l'eau de DDI.

Préparation Principale de Mélange du Tableau 1. Une solution de mélange de maître de cIEF a été effectuée en mélangeant les volumes constitutifs appropriés. Ces volumes comprennent un volume de produits périmés de 20% pour représenter introduire à la pipette l'erreur. La composition unique de partie du mélange principal a contenu 12 mL de Pharmalyte* 3-10 (Santé p/n 17-0456-01 de GE), 20 mL de 500 millimètres de L-Arginine, 2 mL de 200 millimètres IDA, 1,0 mL des repères du peptide pi de 1,25 millimètres, et 200 mL de Gel d'ureacIEF de 3M.

Les phases suivies pour obtenir la solution capillaire de nettoyage sont cotées ci-dessous :

• La solution Capillaire de nettoyage a été effectuée comme solution en vrac par dissolvant g 10,8 d'urée (Sigma p/n U0631) dans 30 ml de l'eau de DDI.
• La solution Capillaire de nettoyage était mélangée jusqu'à ce que tous les solides aient dissous et aient été puis filtrés à l'aide d'un Acrodisc* filtre de seringue de 25 millimètres un pore de 5-mm (Cercueil p/n 4199) pour étant coupé des particules.
• Une solution de gel d'urée-cIEF de 3M a été préparée par dissolvant g 1,80 d'urée (Sigma p/n U1250) dans 9 ml du gel de cIEF (p/n 477497), mélangée pour 15 minimum et chargée dans une seringue 30-mL (Becton Dickenson p/n 309650) et puis filtrée utilisant un pore Acrodisc de 5-mm le filtre de seringue de 25 millimètres (Cercueil p/n 4199) pour retirer des particules.
• La solution de gel d'urée-cIEF de 3M a été dégazée au rcf 2.000 avec un Allegra X centrifugeuse de 15 R (Coutre p/n 392933 de Beckman) et enregistrée à 2-8 °C.
• La solution Cathodique de stabilisateur comportant 500 millimètres Larginine a été effectuée comme un volume de 50 ml par 4,36 dissolvants d'abord g de L-Arginine (98%) (Sigma p/n A5006) solide avec 35 ml de l'eau de DDI dans un ballon jaugé de 50 ml, puis le ballon jaugé a été secoué pour que mn 15 dissolve et finalement augmentant le volume à 50 ml avec de l'eau DDI.
• La solution Anodique de stabilisateur contenant 200 millimètres d'acide iminodiacetic (IDA) a été effectuée comme un volume de 50 ml par dissolvant d'abord g 1,33 d'acide iminodiacetic (98%) (Sigma p/n 220000) solide avec 35 ml d'eau de DDI dans un ballon jaugé de 50 ml.
• Le mélange été secoué pour que mn 15 dissolve tous les solides et le volume a a été grimpé jusqu'à 50 ml utilisant l'eau de DDI.
• La solution de rechange de tampon de mAb qui a contenu 20 millimètres Tris a été effectuée en diluant 4 ml de tampon de 50 millimètres Tris à pH 8,0 (p/n 477427) avec 6 ml de l'eau de DDI.

Préparation des Échantillons du Tableau 2. Mélange Suivant du mélange principal du mL 240, on l'a ajouté à un tube contenant une partie aliquote de mAb dessalé. La solution complète témoin vortexed alors, 200 mL a été transférée dans un tube d'ACP, recouverte avec une goutte unique d'huile minérale (Sigma p/n 8410-5ML) et mise dans une fiole témoin.

La configuration de l'instrument est comme suit :

La procédure de révision suivie est cotée ci-dessous :

• Après l'installation initiale de la cartouche capillaire, le capillaire neutre est conditionné en exécutant d'abord un rinçage à l'eau en submergeant la prise du capillaire dans une fiole en verre contenant de 1,8 ml de l'eau de DDI et appliquant une pression de 50 PSIs à partir du côté de prise pendant 2 Mn.
• Le rinçage à l'eau étendu est suivi d'un faible lavage acide exécuté en submergeant la prise du capillaire dans une fiole contenant 1,8 ml de mobilisateur chimique et appliquant une pression de 50 PSIs à partir du côté de prise pendant 2 Mn.
• Enfin un rinçage de révision est exécuté en submergeant la prise du capillaire dans une fiole contenant 1,8 ml de gel de cIEF de Coutre de Beckman et appliquant une pression de 50 PSIs à partir du côté de prise pendant 5 Mn.

Les échantillons de mAb ont été séparés suivre la méthode suivante de séparation :

• Le capillaire est d'abord nettoyé en submergeant la prise du capillaire dans une fiole contenant 1,8 ml de solution capillaire de nettoyage et appliquant la pression à 50 PSIs à partir du côté de prise pendant 3 Mn.
• Après la phase capillaire de rinçage de solution de nettoyage, le capillaire est vidé avec de l'eau en submergeant la prise du capillaire dans une fiole contenant 1,8 ml d'eau de DDI et appliquant une pression de 50 PSIs à partir du côté de prise pendant 2 Mn.
• La solution témoin de mAb CIEF est introduite dans le capillaire en appliquant une pression de 25 PSIs pour sec 99,9 à partir du côté de prise du capillaire.
• Pendant le nettoyage, des phases de rinçage à l'eau et de charge d'échantillon, le côté de prise du capillaire est mises dans une fiole de rebut.
• Après injection témoin, le gradient est orienté en submergeant le côté de prise du capillaire dans une fiole contenant 1,8 ml d'anolyte et le côté de prise du capillaire dans une fiole contenant 1,8 ml de catholyte et appliquant un potentiel électrique de 25 kilovolts en travers du capillaire pendant 15 Mn.
• Les crêtes orientées sont mobilisées chimiquement pendant le ce que la solution catholyte est remplacée par une fiole contenant 1,8 ml de mobilisateur chimique et appliquant un potentiel électrique de 30 kilovolts en travers du capillaire pendant 20 Mn.
• À la fin de la phase de mobilisation, la collecte des informations est arrêtée et une phase de rinçage à l'eau est exécutée en submergeant la prise du capillaire dans une fiole contenant 1,8 ml d'eau de DDI et appliquant une pression de 50 PSIs à partir du côté de prise pendant 2 Mn.

La méthode d'arrêt concerne ce qui suit :

• L'instrument est arrêté et le capillaire est enregistré sur l'instrument à la fin du jour ouvrable suivre une méthode d'arrêt qui a équilibré la première fois le capillaire en submergeant la prise du capillaire dans une fiole contenant de 1,8 ml de l'eau de DDI et appliquant une pression de 50 PSIs à partir du côté de prise pendant 2 Mn.
• Après le rinçage à l'eau, un rinçage de révision est exécuté en submergeant la prise du capillaire dans une fiole contenant 1,8 ml de gel de cIEF de Coutre de Beckman et appliquant une pression de 50 PSIs à partir du côté de prise pendant 10 Mn.

Le Schéma 1. Conditions Initiales.

Le Schéma 2. Configurations de Détecteur.

Des fioles En Verre contenant 1,6 ml de réactifs de séparation de cIEF ont été mises dans les cuves de tampon avant la séparation dans la commande illustrée sur le Schéma 3. La solution capillaire de nettoyage est montrée par l'abréviation « Solenoïde Propre de Bouchon. » et mobilisateur chimique par « Chem. Mob. » Les Flèches affichent les réactifs qui sont incrémentés par la Méthode de Séparation De base de cIEF de Gradient de pH et le sens de l'incrémentation.

Le Schéma 3. Installation de Cuve de Tampon.

Le domaine et la linéarité pertinents de séparation pour le pH mis en mémoire tampon par ampholyte sont des facteurs essentiels dans le cIEF. Les séparations de cIEF d'une Commission des repères de peptide synthétique avec pi se dirige enjambant le domaine de pH de 4,1 à 10 (le Tableau 3) ont été exécutés suivre la méthode de base de domaine de pH pour évaluer la linéarité. Cette séparation (Fig. 4) prouve que la méthode a un grand choix fonctionnel et est même capable de séparer les repères acides de peptide quand le délai de mobilisation est étendu.

Périodes De Détection De Repère du Tableau 3. pi. Contient les remarques de pi, les séquences des acides aminés et les périodes de détection pour la séparation de repères de pi sur le Schéma 4.

Le Schéma 4. Séparations de cIEF des Repères du Peptide Synthétique pi. Il contient un électrophérogramme de sept repères de peptide synthétique suivre la méthode de base de séparation de cIEF de gradient de pH. La phase de mobilisation était étendue de 35 à 40 mn pour activer le dépistage du repère de pi 4,1.

Analyse de pi contre la période de détection (Fig. 5) pour les repères de peptide synthétique prouve que le gradient est linéaire entre pH 10 et 4,1 avec un coefficient de corrélation de 0,99. Des substances Hautement fondamentales de protéine pas correctement orientées se confondent parfois comme fronts de sel. Ceci est affiché sur le Schéma 4 comme pré-crêtes cathodiques.

Le Schéma 5. Modèle Linéaire de Repère de pi. Un traçage des valeurs de pi contre la période de détection observée pour la séparation des peptides synthétiques comme récapitulée dans le Tableau 1. La mobilisation des repères de pi équipe un modèle linéaire d'un coefficient de corrélation de 0,99 indiquant que le gradient mobilisé de pH est hautement linéaire.

les mAbs tendent à produire des profils complexes d'isoform de charge une fois séparés par le cIEF. Ces profils en plus des valeurs réelles de pi pour les crêtes produisent d'une empreinte digital de « mAb ». C'est pour cette raison que le cIEF peut être un puissant outil dans l'identification et la caractérisation des préparations indépendantes de mAb. Le seul profil maximal pour différents mAbs prouve qu'une méthode unique utilisant un PH3 grand au mélange de l'ampholyte 10 est capable de résoudre des différences dans pi jusqu'à quelques centièmex de 1 ensemble de pH en travers du domaine de base du gradient (Fig. 6).

Le Schéma 6. Séparations de cIEF de Trois mAb De base. Les Électrophérogrammes pour trois mAbs de base ont séparé par le cIEF utilisant les mêmes conditions suivant les indications du Schéma 4.

Afin de tester la précision intermédiaire pour cette méthode, une Commission de trois anticorps a été séparée sur deux instruments utilisant deux un bon nombre différents de capillaire neutre et réactifs six jours indépendants. Toutes Les données ont été intégrées utilisant le logiciel de 32 KaratTM. pi était déterminé par l'outil d'analyse qualitative utilisant les périodes de détection des repères de peptide synthétique de pi 10 et 7. Les crêtes ont été groupées dans un de trois groupes d'isoform pour chaque mAb, de base, principal et acide, et une composition en % a été prévue pour chaque groupe d'isoform (Figs. 7-9). La remarque de pi de sept crêtes de signature et la composition de % de trois groupes d'isoform pour chacun des trois mAbs testés ont été enregistrées. Ces valeurs enregistrées ont été alors employées pour prévoir les coefficients de variation de % (%CV) qui ont été employés pour mesurer la reproductibilité d'analyse.

Le Schéma 7. Profil Maximal de mAb (1). Une fin vers le haut de la vue de la séparation de cIEF de mAb #1.

Analyse Quantitative du Tableau 4. de Séparation de cIEF de mAb #1. L'Analyse quantitative a été effectuée utilisant la remarque de pi de sept crêtes de signature et la composition de % de trois groupes d'isoform.

Le Schéma 8. Profil de Crête de mAb #2. Une fin vers le haut de vue d'une séparation de cIEF de mAb #2.

L'Analyse Quantitative du Tableau 5. de l'Analyse quantitative de mAb #2. a été effectuée suivre la même méthode que mAb #1.

Le Schéma 9. Profil de Crête de mAb #3. Une fin vers le haut de vue d'une séparation de cIEF de mAb #3.

L'Analyse Quantitative du Tableau 6. de l'Analyse quantitative de mAb #3. a été effectuée suivre la même méthode que mAb #1.

Une méthode de séparation unique peut être utilisée pour exécuter l'analyse de cIEF des mAbs multiples en travers d'un domaine grand de pH. L'utilisation d'une méthode unique active préparer les mélanges principaux de séparation qui peuvent aider à réduire introduire à la pipette des erreurs et l'ariability d'inter-échantillon. Le Flux de travail est simplifié à l'aide d'une méthode de plate-forme, réduisant les occasions pour l'erreur de téléphoniste et augmentant la performance globale dans le développement de méthode. L'alimentation électrique analytique de la technique de séparation de cIEF est illustrée par les trois profils maximaux très différents produits dans chaque séparation de mAb. La reproductibilité de la méthode de séparation a été expliquée en conduisant une suite de séparations six jours indépendants utilisant les instruments multiples avec un bon nombre multiples de réactifs. L'Analyse statistique de composition de % de groupe de pi et d'isoform confirme que des séparations hautement reproductibles de cIEF des mAbs peuvent être réalisées même dans la région de base précédemment problématique du gradient de pH.