pH 4 からの 10 への治療上の Monoclonal 抗体の高リゾリューションの cIEF

治療上の蛋白質を特徴付ける (cIEF)ための毛管等電点電気泳動の分離はますます近年採用されてしまいました。pI の決定は治療上の蛋白質の準備の識別、純度、後翻訳の修正および安定性の確立に重大な次元を追加します。 biopharmaceutical 企業で遂行される cIEF の分析のかなりの比率は monoclonal 抗体 (mAbs) の性格描写を含みます。 多くの mAbs に pH の勾配の基本的な範囲で pI の料金の isoforms があります。 基本的な混合物は穴 pH の勾配で基本的な領域、また腐食を一定時間にわたり構成する ampholytes の不十分な性質による cIEF の挑戦を提供します。 cIEF のサンプル解決のヘルプへの陰極および陽極の安定装置の付加はこれらの障害を克服します。 さらに、安定装置の解決ボリュームの最適化、集中の時および両性電解質の集中は完全な pH の範囲全体使用することができる単一方法の開発を可能にします。 この作戦はまたプラットホーム方法と言われる製品のパイプラインの性格描写のための単一のプロトコルの開発を可能にします。 これは必要性および biopharmaceutical 企業の多様性による簡単にするために重要な点です。 これらの努力の結果はオペレータ・エラーまたはシステム変化に傾向がある強く、携帯用解析技法の開発より少なくです。

mAb のサンプルの準備は下記に記載されているように行われます:

• 基本的な治療上の mAb (5-10 の mg/mL) の 500 の mL ボリュームは Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530 の Millipore、 Billerica、 MA) に分かれ、ロードされます。
• 12 の k の rcf の Microfuge 18 (p/n 367160、 Beckman Coulter、 Inc.、 Fullerton、 CA) の 5 分の遠心分離の後で、フィルタに掛けられたボリュームは 20 の mM Tris バッファ pH 8.0 と取り替えられます。
• 遠心分離およびバッファ置換の 2 つの追加サイクルは行われ、 desalted サンプルはおよそ 50 の mg の一部分に aliquoted、 -20 °C でまたはそれ以下に保存されます。

次のステップは毛管および試薬に関して行われます:

• Beckman の犂刃 50 の mm i.d。 中立毛管 (p/n 477441) は 200 mm aperture が装備されている毛管カートリッジにインストールされています。
• インストールの前に、毛管は入口からの検出の Windows への長さが 20 cm でありのは、アウトレットから検出の Windows への 10 cm がであり、全長が 30.2 cm あった測定されたからです。
• リン酸 200 の mM の含んでいる Anolyte の解決は 85% (w/v) の 550 の mL を (14.6 の M) 二重脱イオンされた水の 39.5 mL のリン酸 (シグマ 438081) 薄くすることによってように 40 の mL の大きさ、 (DDI)準備されました。
• 水酸化ナトリウム 300 の mM の含んでいる Catholyte 解決は 1 つの M の水酸化ナトリウム (シグマ p/n 72082) の 12 の mL を薄くすることによって水 28 の mL のにと同時に 40 の mL の大きさ DDI 準備されました。
• 酢酸 350 の mM の含んでいる化学 mobilizer の解決は氷酢酸の 0.8 mL (99.8%)、 DDI 水の 39 の mL への 17.4 M (シグマ p/n 537020) を薄くすることによってと同時に 40 の mL の大きさ準備されました。

表 1. のマスターの組合せの準備。 cIEF のマスターの組合せの解決は適切な構成ボリュームの混合によってなされました。 これらのボリュームはエラーをピペットで移すために説明するために 20% の overage ボリュームを含んでいます。 マスターの組合せの単一の部分の構成は Pharmalyte* 3-10 (GE のヘルスケア p/n 17-0456-01) の 12 mL、 L アルギニン 500 の mM のの 20 mL、 200 の mM IDA の 2 mL、 1.25 mM のペプチッド pI マーカーの 1.0 mL、および 3 つの M の ureacIEF のゲルの 200 mL を含んでいました。

毛管クリーニングの解決を得るために続かれるステップは下記のようにリストされています:

• 毛管クリーニングの解決は DDI 水の 30 の mL の尿素 (シグマ p/n U0631) の分解の 10.8 の g によってバルク解決としてなされました。
• 毛管クリーニングの解決はすべての固体が 5-mm の気孔 (棺衣 p/n 4199) が付いている Acrodisc* 25 mm のスポイトフィルターを通って分解し、次に粒子を除去するためにフィルタに掛けたまで混合されていました。
• 3 つの M の尿素cIEF のゲルの解決は cIEF のゲル (p/n 477497) の 9 つの mL の尿素 (シグマ p/n U1250) の分解の 1.80 の g によって準備され、最小 15 のために混合され、そして 30 mL スポイトに (Becton Dickenson p/n 309650) ロードされ、そして次に 5-mm の気孔の Acrodisc 25 mm のスポイトフィルター (棺衣 p/n 4199) を使用して粒子を除去するためにフィルタに掛けました。
• 3 つの M の尿素cIEF のゲルの解決は Allegra X の 2,000 rcf で 15 の R の遠心分離機 (Beckman の犂刃 p/n 392933) ガスを抜かれ、 2-8 °C. で保存されました。
• 500 の mM Larginine から成り立つ陰極安定装置の解決は L アルギニン (98%) (シグマ p/n A5006) の最初に分解の 4.36 g によってように 50 の mL の大きさなされ 50 の mL の容積測定フラスコの DDI 水の 35 の mL の固体、そして容積測定フラスコは 15 分の間分解するために揺れ、 DDI 水との 50 の mL に最終的にボリュームを増加します。
• iminodiacetic 酸 200 の mM の含んでいる陽極の安定装置の解決は (IDA) iminodiacetic 酸の最初に分解の 1.33 の g によってように 50 の mL の大きさ (98%) (シグマ p/n 220000) なされました 50 の mL の容積測定フラスコの水 35 の mL のの固体 DDI。
• 混合物は 15 分の間すべての固体を分解するために揺れ、ボリュームは DDI 水を使用して 50 の mL に増加しました。
• 20 の mM Tris を含んでいた mAb バッファ置換の解決は DDI 水の 6 つの mL と pH 8.0 (p/n 477427) の 50 の mM Tris バッファの 4 つの mL を薄くすることによってなされました。

表 2. のサンプル準備。 240 mL のマスターの組合せの続く混合、それは desalted mAb の因数を含んでいる管に追加されました。 完全なサンプル解決は PCR の管にそれから、 200 mL 転送され、鉱油の単一の低下とオーバーレイをされ、 (シグマ p/n 8410-5ML) そしてサンプルガラスびんに置かれました vortexed。

器械の構成は次の通りあります:

続かれる調節プロシージャは下記のようにリストされています:

• 毛管カートリッジの初期インストールの後で、中立毛管は最初に DDI 水の 1.8 mL を含み、 2 Min. の入口の側面から圧力の 50 の psi を適用するガラスガラスびんに毛管の入口を水中に沈めることによる水洗浄を行うことによって調節されます。
• 拡張水洗浄は弱いのに酸性染料で色落ちします化学 mobilizer の 1.8 人の mL を含み、 2 Min. の入口の側面から圧力の 50 の psi を適用するガラスびんに毛管の入口を水中に沈めることによって行われて先行しています。
• 最後に調節の洗浄は Beckman の犂刃の cIEF のゲルの 1.8 mL を含み、 5 Min. の入口の側面から圧力の 50 の psi を適用するガラスびんに毛管の入口を水中に沈めることによって行われます。

mAb のサンプルは次の分離法を使用して分かれていました:

• 毛管は毛管クリーニングの解決の 1.8 mL を含み、 3 Min. の入口の側面から 50 の psi の圧力を適用するガラスびんに毛管の入口を水中に沈めることによって最初にきれいになります。
• 毛管クリーニングの解決の洗浄のステップに従がって、毛管は水と水 1.8 mL の DDI 含み、 2 Min. の入口の側面から圧力の 50 の psi を適用するガラスびんに毛管の入口を水中に沈めることによってフラッシュされます。
• mAb CIEF のサンプル解決は毛管に毛管の入口の側面から 99.9 秒のための圧力の 25 の psi を適用することによってもたらされます。
• クリーニングの間に、水洗浄およびサンプルローディングのステップは不用なガラスびんに、毛管のアウトレット側面置かれます。
• サンプル注入の後で、勾配は catholyte の 1.8 mL を含み、 15 Min. の毛管を渡る 25 の kV の電気潜在性を適用するガラスびんに anolyte の 1.8 mL をおよび毛管のアウトレット側面を水中に沈めることによって含んでいるガラスびんに毛管の入口の側面集中します。
• 集中されたピークは catholyte 解決が化学 mobilizer の 1.8 人の mL を含み、 20 Min. の毛管を渡る 30 の kV の電気潜在性を適用するガラスびんによって取り替えられるかどれをの間に化学的に動員されます。
• 動員のステップの完了の後で、データ収集は停止し、水洗浄のステップは水 1.8 mL の DDI 含み、 2 Min. の入口の側面から圧力の 50 の psi を適用するガラスびんに毛管の入口を水中に沈めることによって行われます。

シャットダウン方法は次を含みます:

• 器械はシャットダウンされ、毛管は DDI 水の 1.8 mL を含み、 2 Min. の入口の側面から圧力の 50 の psi を適用するガラスびんに毛管の入口を水中に沈めることによって最初に毛管を平衡させたシャットダウン方法を使用して仕事日の終わりに器械で保存されます。
• 水洗浄の後で、調節の洗浄は Beckman の犂刃の cIEF のゲルの 1.8 mL を含み、 10 Min. の入口の側面から圧力の 50 の psi を適用するガラスびんに毛管の入口を水中に沈めることによって行われます。

図 1. 最初の条件。

図 2. 探知器の設定。

cIEF の分離の試薬の 1.6 mL を含んでいるガラスガラスびんは図 3. で説明された順序で分離前にバッファ皿に置かれました。 毛管クリーニングの解決は省略 「帽子きれいな SOL によって指定されます」。 そして 「Chem 著化学 mobilizer。 暴徒」。 矢は増分の基本的な pH の勾配の cIEF の分離法そして方向によって増分する試薬を示します。

図 3. バッファ皿セットアップ。

両性電解質によって緩衝される pH のための有効な分離の範囲そして直線性は cIEF の必要な要因です。 pI の総合的なペプチッドマーカーのパネルの cIEF の分離は指しま 4.1 から 10 の pH の範囲に及びます (直線性を査定するために表 3) は基本的な pH の範囲方法を使用して行われました。 動員時間が拡張である時方法に広い機能範囲があり、酸性ペプチッドマーカーを分けることができることをこの分離 (図 4) は示します。

表 3. pI のマーカーの探知時間。 図 4. で pI のマーカーの分離のための pI ポイント、アミノ酸シーケンスおよび探知時間を含んでいます。

図 4. 総合的なペプチッド pI マーカーの cIEF の分離。 それは基本的な pH の勾配の cIEF の分離法を使用して 7 つの総合的なペプチッドマーカーの electropherogram を含んでいます。 動員のステップは 35 から 40 分に拡張 pI 4.1 のマーカーの検出を可能にするためにでした。

勾配が 0.99 の相関係数の pH 10 および 4.1 間で線形であることを pI の分析対探知時間 (総合的なペプチッドマーカーのための図 5) は示します。 きちんと集中しない非常に基本的な蛋白質種は時々塩の前部として誤解されます。 これは陰極前ピークとして図 4 で示されています。

図 5. pI のマーカーの線形モデル。 pI 値のプロット対表 1. に要約されて総合的なペプチッドの分離のために観察される探知時間。 pI のマーカーの動員は動員された pH の勾配が非常に線形であることを示す 0.99 の相関係数と線形モデルに合います。

mAbs は cIEF で分けられたとき複雑な料金の isoform のプロフィールを生成しがちです。 ピークのための実際の pI 値に加えるこれらのプロフィールは 「mAb」の指紋を生成します。 それはこのような理由で cIEF が別の mAb の準備の識別そして性格描写の強力なツールである場合もあることです。 異なった mAbs のための一義的なピークプロフィールは広い pH 3 から 10 を使用して単一方法が両性電解質の混合物勾配 (図 6) の基本的な範囲を渡る 1 つの pH の単位の少数の第百まで pI の相違を解決することができることを示します。

図 6. 3 基本的な mAb's の cIEF の分離。 3 つの基本的な mAbs のための Electropherograms は図 4. に示すように同じ条件を使用して cIEF で分かれました。

この方法のために中間精密をテストするためには、 3 つの抗体のパネルは中立毛管の 2 つの多くを使用して 2 つの器械および 6 つの別々の日の試薬で分かれていました。 すべてのデータは 32 KaratTM のソフトウェアを使用して統合されていました。 pI は pI 10 および 7 の総合的なペプチッドマーカーの探知時間を使用して定性分析のツールを通して断固としたでした。 ピークは各 mAb のための 3 つの isoform のグループの 1 つに、基本的で、主要、酸性グループ化され、パーセントの構成は各 isoform のグループ (Figs. 7-9) のために計算されました。 7 つの署名のピークの pI ポイントおよびテストされた 3 つの mAbs のそれぞれのための 3 つの isoform のグループのパーセントの構成は記録されました。 これらの記録された値がそれから試金の再現性を正確に測るのに使用された変化 (%CV) のパーセント係数を計算するのに使用されました。

図 7. mAb (1) のピークプロフィール。 mAb #1 の cIEF の分離の眺めの上の終わり。

mAb #1 の cIEF の分離の表 4. の数量化解析。 数量化解析は 7 つの署名のピークの pI ポイントおよび 3 つの isoform のグループのパーセントの構成を使用して行われました。

図 8. mAb #2 のピークのプロフィール。 mAb #2 の cIEF の分離の眺めの上の終わり。

mAb #2. の数量化解析の表 5. の数量化解析は mAb #1. と同じ方法を使用して行われました。

図 9. mAb #3 のピークのプロフィール。 mAb #3 の cIEF の分離の眺めの上の終わり。

mAb #3. の数量化解析の表 6. の数量化解析は mAb #1. と同じ方法を使用して行われました。

単一の分離法は広い pH の範囲を渡る多重 mAbs の cIEF の分析を行うために用いることができます。 単一方法の使用はエラーおよび相互サンプル ariability をピペットで移すことを減るのを助けることができるマスターの分離の組合せを準備することを可能にします。 作業の流れはチャンスを減らし、方法開発で総合効率を高めるオペレータ・エラーのためにプラットホーム方法を使用することによって簡素化されます。 cIEF の分離技術の分析的な力は各 mAb の分離で作り出される 3 つの非常に異なったピークプロフィールによって説明されます。 分離法の再現性は試薬の多重多くが付いている多重器械を使用して 6 つの別々の日の一連の分離を行なうことによって示されました。 pI および isoform のグループのパーセントの構成の統計分析は mAbs の非常に再生可能な cIEF の分離を pH の勾配の前に問題となる基本的な領域で達成することができることを確認します。