Hoge Resolutie cIEF van Therapeutische Monoclonal Antilichamen van pH 4 tot 10

De Capillaire isoelectric concentrerende (cIEF) scheiding voor het kenmerken van therapeutische proteïnen is meer en meer de laatste jaren goedgekeurd. De bepaling van pi voegt een kritieke afmeting aan het vestigen van identiteit, zuiverheid, post-vertalende wijziging en stabiliteit van therapeutische eiwitvoorbereidingen toe. Een significant deel cIEFanalyses die in de biopharmaceutical industrie worden uitgevoerd impliceert karakterisering van monoclonal antilichamen (mAbs). Vele mAbs hebben last isoforms met pi in de basiswaaier van de pH gradiënt. De Basis samenstellingen bieden een uitdaging in cIEF toe te schrijven aan de ontoereikende aard van ampholytes aan bestaand uit het basisgebied evenals bederf van de gatenpH gradiënt in tijd. De Toevoeging van kathodische en anodestabilisatoren aan de de oplossingshulp van de cIEFsteekproef overwint deze hindernissen. Bovendien, laat de optimalisering van de volumes van de stabilisatoroplossing, die tijden, en ampholyte concentratie concentreren ontwikkeling van één enkele methode toe die door de volledige pH waaier kan worden gebruikt. Deze strategie laat de ontwikkeling van één enkel die protocol voor de karakterisering van de productpijpleiding ook toe als platformmethode wordt bedoeld. Dit is een belangrijk punt toe te schrijven aan de behoefte aan eenvoud en veelzijdigheid in de biopharmaceutical industrie. Het resultaat van deze inspanningen is de ontwikkeling van een robuuste en draagbare analytische techniek minder naar voren gebogen aan exploitantfout of systeemvariatie.

De voorbereiding van mAbsteekproeven wordt uitgevoerd zoals hieronder vermeld:

• Een 500 mLvolume van een fundamentele therapeutische mAb (5-10 mg/ml) is ontdooid en geladen in een Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530, Millipore, Billerica, DOCTORANDUS IN DE LETTEREN).
• Na centrifugeren voor 5 min in een Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Kouter, Inc., Fullerton, CA) bij 12 k rcf, wordt het gefiltreerde volume vervangen met 20 mmTris buffer pH 8.0.
• Twee extra cycli van centrifugeren en buffervervanging wordt gedaan en de ontzilte steekproef is aliquoted in ongeveer 50 mgfracties en opsloeg bij -20 °C of hieronder.

De volgende stappen worden uitgevoerd met betrekking tot haarvaten en reagentia:

• Een Beckman Kouter 50 mm i.d. Het Neutrale Haarvat (p/n 477441) is geïnstalleerd in een Capillaire die Patroon met een 200 mmaperture wordt uitgerust.
• Vóór installatie, werd het haarvat gemeten zodat zijn totale lengte 30.2 cm was en de lengte van inham aan opsporingsvenster 20 cm was en van de afzet aan de opsporing was het venster 10 cm.
• Oplossingen die van Anolyte 200 mm bevatten fosforwerdenzuur voorbereid als 40 mlmassa, door 550 ml van 85% (w/v) te verdunnen (14.6 M) fosforzuur (Sigma 438081) met 39.5 ml dubbel-gedeioniseerd (DDI) water.
• Catholyte oplossingen die 300 van het natrium bevatten werdenmm hydroxyde voorbereid als 40 mlmassa door 12 ml het natriumhydroxyde van 1 M (Sigma p/n 72082) in 28 ml van DDI te verdunnen het water.
• De Chemische mobilizeroplossingen die 350 mm bevatten werden azijnzuur voorbereid als 40 mlmassa door 0.8 ml ijzig azijnzuur (99.8%), 17.4 M (Sigma p/n 537020) in 39 ml water te verdunnen DDI.

Lijst 1. De Hoofd Voorbereiding van de Mengeling. Een oplossing van de cIEF hoofdmengeling werd gemaakt door de aangewezen componentenvolumes te mengen. Deze volumes omvatten een 20% overschotvolume om van het pipetting van fout rekenschap te geven. De enige gedeeltesamenstelling van de hoofdmengeling bevatte 12 mL van Pharmalyte* 3-10 (de Gezondheidszorg p/n 17-0456-01 van GE), 20 mL van 500 mm l--Arginine, 2 mL van 200 mm IDA, 1.0 mL van 1.25 mmpeptide pi tellers, en 200 mL van 3M ureacIEF Gel.

De stappen worden gevolgd om de capillaire het schoonmaken oplossing te verkrijgen die zijn hieronder vermeld:

• De Capillaire het schoonmaken oplossing werd gemaakt als bulkoplossing door 10.8 g ureum (Sigma p/n U0631) in 30 ml water op te lossen DDI.
• De Capillaire het schoonmaken oplossing werd gemengd tot alle vaste lichamen toen door een Acrodisc* de filter van de 25 mmspuit met een 5-mmporie (Baarkleed p/n 4199) om deeltjes te verwijderen werden oplosten en gefiltreerd.
• Een 3M oplossing van het ureum -ureum-cIEFgel werd voorbereid door 1.80 g ureum (Sigma p/n U1250) in 9 ml van cIEFgel (p/n 477497) op te lossen, gemengd voor 15 min en werd geladen in een spuit 30-ml (Becton Dickenson p/n 309650) en werd werd toen gefiltreerd gebruikend een 5-mmporie Acrodisc de filter van de 25 mmspuit (Baarkleed p/n 4199) om deeltjes te verwijderen.
• De 3M oplossing van het ureum -ureum-cIEFgel werd ontgast bij rcf 2.000 met een Allegra X 15 R centrifugeert (Beckman Kouter p/n 392933) en opgeslagen bij 2-8 °C.
• De Kathodische stabilisatoroplossing die uit 500 mm Larginine bestaat werd gemaakt aangezien werd een 50 mlmassa door 4.36 g van l-Arginine (98%) (Sigma p/n A5006) vast lichaam met 35 ml water DDI in een 50 ml volumetrische fles eerst op te lossen, dan de volumetrische fles geschud voor 15 min om op te lossen en definitief verhogend het volume tot 50 ml met water DDI.
• De Anode stabilisatoroplossing die 200 mm bevat iminodiacetic werd zuur (IDA) gemaakt als 50 mlmassa door 1.33 g van iminodiacetic zuur (98%) eerst op te lossen (Sigma p/n 220000) vast lichaam met 35 ml van DDI het water in een 50 ml volumetrische fles.
• Het mengsel werd geschud voor 15 min om alle vaste lichamen op te lossen en het volume werd verhoogd tot 50 ml gebruikend water DDI.
• De de vervangingsoplossing van de mAbbuffer die 20 mm Tris bevatte werd gemaakt door 4 ml van 50 mmTris buffer bij pH 8.0 (p/n 477427) met 6 ml water te verdunnen DDI.

Lijst 2. De Voorbereiding van de Steekproef. Na zich het mengen van de 240 mL hoofdmengeling, werd het aan een buis toegevoegd die een gedeelte van ontzilt bevat mAb. De volledige steekproefoplossing was toen vortexed, werd 200 mL overgebracht in een PCR buis, bedekt met één enkele daling van minerale olie (Sigma p/n 8410-5ML) en werd geplaatst in een steekproefflesje.

De configuratie van het instrument is als volgt:

De conditionerende gevolgde procedure is hieronder vermeld:

• Na aanvankelijke installatie van de capillaire patroon, wordt het neutrale haarvat door een waterspoeling eerst uit te voeren door de inham van het haarvat in een glasflesje geconditioneerd onder te dompelen dat 1.8 ml water DDI bevat en 50 psi van druk van de inhamkant toepast voor 2 min.
• De uitgebreide waterspoeling wordt door een zwakke zure die was gevolgd door de inham van het haarvat in een flesje wordt uitgevoerd onder te dompelen dat 1.8 ml chemische mobilizer bevat en 50 psi van druk van de inhamkant toepast voor 2 min.
• Tot Slot wordt een conditionerende spoeling door de inham van het haarvat in een flesje uitgevoerd onder te dompelen dat 1.8 ml van het gel van het Kouter bevat Beckman cIEF en 50 psi van druk van de inhamkant toepast voor 5 min.

De mAbsteekproeven waren gescheiden gebruikend de volgende scheidingsmethode:

• Het haarvat wordt eerst door de inham van het haarvat in een flesje schoongemaakt onder te dompelen dat 1.8 ml capillaire het schoonmaken oplossing bevat en het toepassen van druk bij 50 psi van de inhamkant voor 3 min.
• Na de capillaire schoonmakende stap van de oplossingsspoeling, wordt het haarvat met water door de inham van het haarvat in een flesje gespoeld onder te dompelen dat 1.8 ml bevat van DDI het water en 50 psi van druk van de inhamkant toepast voor 2 min.
• De oplossing van de mAbCIEF steekproef wordt geïntroduceerd in het haarvat door 25 psi van druk voor 99.9 seconden van de inhamkant van het haarvat toe te passen.
• Tijdens het schoonmaken, waterspoeling en steekproef wordt de ladingsstappen, de afzetkant van het haarvat geplaatst in een afvalflesje.
• Na steekproefinjectie, wordt de gradiënt door de inhamkant van het haarvat in een flesje geconcentreerd dat 1.8 ml anolyte bevat en de afzetkant van het haarvat onder te dompelen in een flesje dat 1.8 ml van catholyte bevat en een 25 kV elektropotentieel over het haarvat toepast voor 15 min.
• De geconcentreerde pieken worden chemisch gemobiliseerd waarin de catholyte oplossing met een flesje vervangen wordt dat 1.8 ml chemische mobilizer bevat en een 30 kV elektropotentieel over het haarvat toepast voor 20 min.
• Na voltooiing van de mobiliseringsstap, wordt de gegevensinzameling tegengehouden en een stap van de waterspoeling wordt door de inham van het haarvat in een flesje uitgevoerd onder te dompelen dat 1.8 ml bevat van DDI het water en 50 psi van druk van de inhamkant toepast voor 2 min.

De sluitingsmethode houdt het volgende in:

• Het instrument is gesloten en het haarvat wordt opgeslagen op het instrument begin de werkdag gebruikend een sluitingsmethode die in evenwicht eerst het haarvat door de inham van het haarvat in een flesje bracht onder te dompelen dat 1.8 ml water DDI bevat en 50 psi van druk van de inhamkant toepast voor 2 min.
• Na de waterspoeling, wordt een conditionerende spoeling door de inham van het haarvat in een flesje uitgevoerd onder te dompelen dat 1.8 ml van het gel van het Kouter bevat Beckman cIEF en 50 psi van druk van de inhamkant toepast voor 10 min.

Figuur 1. Aanvankelijke Voorwaarden.

Figuur 2. De Montages van de Detector.

Flesjes die van het Glas 1.6 die ml reagentia van de cIEFscheiding bevatten werden in de bufferdienbladen voorafgaand aan scheiding in de orde geplaatst in Figuur 3 wordt geïllustreerd. De capillaire het schoonmaken oplossing wordt aangewezen door de afkortings „GLB Schone Sol.“ en chemische mobilizer door „Chem. Menigte.“ De Pijlen tonen de reagentia die door de BasispH Methode van de Scheiding van de Gradiënt cIEF en de richting van het verhogen worden verhoogd.

Figuur 3. De Opstelling van het Dienblad van de Buffer.

De efficiënte scheidingswaaier en de lineariteit voor ampholyte voor als buffer opgetreden pH zijn essentiële factoren in cIEF. De cIEFscheidingen van een paneel van synthetische peptide tellers met pipunten die de pH waaier van 4.1 overspannen tot 10 (Lijst 3) werden uitgevoerd gebruikend de basispH waaiermethode om lineariteit te beoordelen. Deze scheiding (Fig. 4) toont aan dat de methode een brede functionele waaier heeft en zelfs de zuurrijke peptide tellers kan scheiden wanneer de mobiliseringstijd wordt uitgebreid.

Lijst 3. de Tijden van de Opsporing van de Teller van pi. Bevat de pipunten, de aminozuuropeenvolgingen en de opsporingstijden voor de scheiding van pitellers in Figuur 4.

Figuur 4. cIEF Scheidingen van Synthetische Peptide pi Tellers. Het bevat een elektropherogram van zeven synthetische peptide tellers gebruikend de basispH methode van de gradiënt cIEF scheiding. De mobiliseringsstap werd uitgebreid van 35 tot 40 minuten om de opsporing van de pi 4.1 teller toe te laten.

De Analyse van pi tegenover opsporingstijd (Fig. 5) voor de synthetische peptide tellers toont aan dat de gradiënt tussen pH 10 en 4.1 met een correlatiecoëfficiënt van 0.99 lineair is. De Hoogst fundamentele eiwit niet behoorlijk geconcentreerde species zijn soms verkeerd als zoute voorzijden. Dit wordt getoond in Figuur 4 als kathodische pre-pieken.

Figuur 5. het Lineaire Model van de Teller van pi. Een perceel van piwaarden tegenover opsporingstijd voor scheiding van synthetische peptides wordt waargenomen zoals samengevat in Lijst 1 die. De mobilisering van de pitellers past een lineair model met een correlatiecoëfficiënt van 0.99 erop wijzend dat de gemobiliseerde pH gradiënt hoogst lineair is.

mAbs neig om complexe lasten isoform profielen te produceren wanneer gescheiden door cIEF. Deze profielen naast daadwerkelijke piwaarden voor de pieken produceren een „mAb“ vingerafdruk. Het is om deze reden dat cIEF een krachtig hulpmiddel in de identificatie en de karakterisering van afzonderlijke mAbvoorbereidingen kan zijn. Het unieke piekprofiel voor verschillende mAbs toont aan dat één enkele methode die brede pH ampholyte 3 gebruikt tot 10 mengsel verschillen in pi tot een paar honderdste van 1 pH eenheid over de basiswaaier van de gradiënt (Fig. 6) kan oplossen.

Figuur 6. cIEF Scheidingen van Drie BasismAb. Elektropherogrammen voor drie basisdiemAbs door cIEF wordt gescheiden die de zelfde voorwaarden zoals aangetoond in Figuur 4 gebruikt.

om middenprecisie voor deze methode te testen, werd een paneel van drie antilichamen gescheiden op twee instrumenten gebruikend twee verschillende partijen van neutraal haarvat en reagentia op zes afzonderlijke dagen. Al gegevens waren geïntegreerd gebruikend software 32 KaratTM. pi werd bepaald door het kwalitatieve analysehulpmiddel gebruikend de opsporingstijden van pi 10 en 7 synthetische peptide tellers. De pieken werden gegroepeerd in één van drie isoformgroepen voor elke mAb, basis, belangrijkst en zuurrijk, en een percentensamenstelling werd berekend voor elke isoformgroep (Fign. 7-9). Het pipunt van zeven handtekeningspieken en de percentensamenstelling van drie isoformgroepen voor werden elk van drie geteste mAbs geregistreerd. Deze geregistreerde waarden werden toen gebruikt om percentenvariatiecoëfficiënten te berekenen (%CV) die werden gebruikt om analysereproduceerbaarheid te meten.

Figuur 7. mAb (1) PiekProfiel. Een dichte omhooggaande mening van de mAb#1 cIEF scheiding.

Lijst 4. Kwantitatieve Analyse van mAb#1 cIEF Scheiding. De Kwantitatieve analyse werd uitgevoerd gebruikend het pipunt van zeven handtekeningspieken en de percentensamenstelling van drie isoformgroepen.

Figuur 8. mAb #2 PiekProfiel. Een dichte omhooggaande mening van een mAb#2 cIEF scheiding.

Lijst 5. Kwantitatieve Analyse van mAb #2. De Kwantitatieve analyse werd uitgevoerd gebruikend de zelfde methode zoals mAb #1.

Figuur 9. mAb #3 PiekProfiel. Een dichte omhooggaande mening van een mAb#3 cIEF scheiding.

Lijst 6. Kwantitatieve Analyse van mAb #3. De Kwantitatieve analyse werd uitgevoerd gebruikend de zelfde methode zoals mAb #1.

Één enkele scheidingsmethode kan worden aangewend om cIEF analyse van veelvoudige mAbs over een brede pH waaier uit te voeren. Het gebruik van één enkele methode laat het voorbereiden van hoofdscheidingsmengelingen die toe kunnen helpen het pipetting van fouten en inter-steekproefariability verminderen. Het Werkschema wordt vereenvoudigd door het gebruiken van een platformmethode, de kansen voor exploitantfout te verminderen en algemene efficiency in methodeontwikkeling te verhogen. De analytische macht van de techniek van de cIEFscheiding wordt door de drie zeer verschillende piekdieprofielen geïllustreerd in elke mAbscheiding worden veroorzaakt. De reproduceerbaarheid van de scheidingsmethode werd aangetoond door een reeks scheidingen op zes afzonderlijke dagen te leiden gebruikend veelvoudige instrumenten met veelvoudige partijen van reagentia. De Statistische analyse van pi en isoform groepspercentensamenstelling bevestigt dat de hoogst reproduceerbare cIEFscheidingen van mAbs zelfs in het eerder problematische basisgebied van de pH gradiënt kunnen worden bereikt.