CIEF De alta resolução de Anticorpos Monoclonais Terapêuticos do pH 4 a 10

A separação Capilar da focagem (cIEF) isoeléctrica para caracterizar proteínas terapêuticas tem sido adotada cada vez mais nos últimos anos. A determinação do pi adiciona uma dimensão crítica a estabelecer a identidade, a pureza, a alteração cargo-translational e a estabilidade de preparações terapêuticas da proteína. Uma proporção significativa de análises do cIEF que estão sendo realizadas na indústria biofarmaceutico envolve a caracterização de anticorpos monoclonais (mAbs). Muitos mAbs têm isoforms da carga com um pi na escala básica do inclinação do pH. Os compostos Básicos oferecem um desafio no cIEF devido à natureza inadequada dos ampholytes que compreendem a região assim como a deterioração básicas do inclinação do pH do furo ao longo do tempo. A Adição de estabilizadores catódicos e anódicos às ajudas da solução da amostra do cIEF supera estes obstáculos. Adicionalmente, a optimização de volumes da solução do estabilizador, os tempos de focalização, e a concentração do ampholyte permitem a revelação de um único método que possa ser usado durante todo a escala completa do pH. Esta estratégia permite a revelação de um único protocolo para a caracterização do encanamento do produto igualmente referida como um método da plataforma. Este é um aspecto importante devido à necessidade para a simplicidade e à versatilidade na indústria biofarmaceutico. O resultado destes esforços é a revelação de uma variação robusta e portátil do erro ou do sistema de operador menos inclinado analítico da técnica.

A preparação de amostras do mAb é executada como alistada abaixo:

• Uns 500 volumes do mL de um mAb terapêutico básico (5-10 mg/mL) thawed e são carregados em um Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530, Millipore, Billerica, MILIAMPÈRE).
• Após a centrifugação para o minuto 5 em um Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Relha, Inc., Fullerton, CA) no rcf de 12 k, o volume filtrado é substituído com o pH 8,0 do amortecedor de 20 milímetros Tris.
• Dois ciclos adicionais da substituição da centrifugação e do amortecedor são feitos e a amostra dessalinizada aliquoted em aproximadamente 50 fracções do mg e é armazenada no °C -20 ou abaixo.

As seguintes etapas são executadas no que diz respeito aos capilares e aos reagentes:

• Uma identificação do mm da Relha 50 de Beckman. O Capilar Neutro (p/n 477441) é instalado em um Cartucho Capilar equipado com uns 200 aperture do milímetro.
• Antes da instalação, o capilar foi medido de modo que seu comprimento total fosse 30,2 cm e o comprimento da entrada ao indicador da detecção fosse 20 cm e da tomada ao indicador da detecção fossem 10 cm.
• As soluções de Anolyte que contêm 200 milímetros de ácido fosfórico foram preparadas como um volume de 40 mL, diluindo 550 mL de 85% (w/v) (M) 14,6 ácido fosfórico (Sigma 438081) com 39,5 mL da água (DDI) dobro-deionized.
• As soluções Católitas que contêm 300 milímetros de hidróxido de sódio foram preparadas enquanto um volume de 40 mL diluindo 12 mL do hidróxido de sódio de 1 M (Sigma p/n 72082) em 28 mL de água de DDI.
• As soluções Químicas do mobilizer que contêm 350 milímetros de ácido acético foram preparadas enquanto um volume de 40 mL diluindo 0,8 mL do ácido acético glacial (99,8%), 17,4 M (Sigma p/n 537020) em 39 mL da água de DDI.

Preparação Mestra da Mistura da Tabela 1. Uma solução da mistura do mestre do cIEF foi feita misturando os volumes componentes apropriados. Estes volumes incluem um volume do excedente de 20% para esclarecer introduzir com pipeta o erro. A única composição da parcela da mistura mestra conteve 12 mL de Pharmalyte* 3-10 (Cuidados Médicos p/n 17-0456-01 de GE), 20 mL de 500 milímetros de L-Arginina, 2 mL de 200 milímetros IDA, 1,0 mL de marcadores do pi do peptide de 1,25 milímetros, e 200 mL do Gel do ureacIEF de 3M.

As etapas seguidas para obter a solução capilar da limpeza estão listadas abaixo:

• A solução Capilar da limpeza foi feita como uma solução maioria por g 10,8 de dissolução da uréia (Sigma p/n U0631) em 30 mL da água de DDI.
• A solução Capilar da limpeza foi misturada até que todos os sólidos se dissolveram e fossem filtrados então com um Acrodisc* filtro da seringa de 25 milímetros com um poro do 5-mm (Nuvem p/n 4199) para remover as partículas.
• Uma solução do gel da uréia-cIEF de 3M foi preparada por g 1,80 de dissolução da uréia (Sigma p/n U1250) em 9 mL do gel do cIEF (p/n 477497), misturada para 15 mínimos e carregada em uma seringa 30-mL (Becton Dickenson p/n 309650) e filtrada então usando um poro Acrodisc do 5-mm filtro da seringa de 25 milímetros (Nuvem p/n 4199) para remover as partículas.
• A solução do gel da uréia-cIEF de 3M foi desgaseificada no rcf 2.000 com um Allegra X centrifugador de 15 R (Relha p/n 392933 de Beckman) e armazenada em 2-8 °C.
• A solução Catódica do estabilizador que compreende 500 milímetros Larginine foi feita como um volume de 50 mL por 4,36 primeiramente de dissolução g da L-Arginina (98%) (Sigma p/n A5006) sólido com 35 mL da água de DDI em uma garrafa volumétrico de 50 mL, a seguir a garrafa volumétrico foi agitada para que o minuto 15 dissolva-se e finalmente aumentando o volume a 50 mL com água de DDI.
• A solução Anódica do estabilizador que contem 200 milímetros de ácido iminodiacetic (IDA) foi feita como um volume de 50 mL por g 1,33 primeiramente de dissolução de ácido iminodiacetic (98%) (Sigma p/n 220000) sólido com 35 mL de água de DDI em uma garrafa volumétrico de 50 mL.
• A mistura foi agitada para que o minuto 15 dissolva todos os sólidos e o volume foi aumentado a 50 mL usando a água de DDI.
• A solução da substituição do amortecedor do mAb que conteve 20 milímetros Tris foi feita diluindo 4 mL do amortecedor de 50 milímetros Tris no pH 8,0 (p/n 477427) com os 6 mL da água de DDI.

Preparação da Amostra da Tabela 2. Mistura de Seguimento da mistura mestra do mL 240, adicionou-se a uma câmara de ar que contem uma parte alíquota do mAb dessalinizado. A solução completa da amostra vortexed então, 200 mL foi transferida em uma câmara de ar do PCR, coberta com uma única gota de óleo mineral (Sigma p/n 8410-5ML) e colocada em um tubo de ensaio da amostra.

A configuração do instrumento é como segue:

O procedimento de acondicionamento seguido está listado abaixo:

• Após a instalação inicial do cartucho capilar, o capilar neutro é condicionado primeiramente executando uma lavagem de água submergindo a entrada do capilar em um tubo de ensaio de vidro que contem 1,8 mL da água de DDI e que aplica 50 libras por polegada quadrada da pressão do lado da entrada por 2 Min.
• A lavagem de água prolongada é seguida por uma lavagem ácida fraca executada submergindo a entrada do capilar em um tubo de ensaio que contem 1,8 mL do mobilizer químico e que aplica 50 libras por polegada quadrada da pressão do lado da entrada por 2 Min.
• Uma lavagem de acondicionamento é executada Finalmente submergindo a entrada do capilar em um tubo de ensaio que contem 1,8 mL do gel do cIEF da Relha de Beckman e que aplica 50 libras por polegada quadrada da pressão do lado da entrada por 5 Min.

As amostras do mAb foram separadas usando o seguinte método de separação:

• O capilar é limpado primeiramente submergindo a entrada do capilar em um tubo de ensaio que contem 1,8 mL da solução capilar da limpeza e que aplica a pressão em 50 libras por polegada quadrada do lado da entrada por 3 Min.
• Depois da etapa capilar da lavagem da solução da limpeza, o capilar é nivelado com água submergindo a entrada do capilar em um tubo de ensaio que contem 1,8 mL de água de DDI e que aplica 50 libras por polegada quadrada da pressão do lado da entrada por 2 Min.
• A solução da amostra do mAb CIEF é introduzida no capilar aplicando 25 libras por polegada quadrada da pressão para o segundo 99,9 do lado da entrada do capilar.
• Durante a limpeza, as etapas da carga da lavagem de água e da amostra, o lado de tomada do capilar são colocadas em um tubo de ensaio waste.
• Após a injecção da amostra, o inclinação é focalizado submergindo o lado da entrada do capilar em um tubo de ensaio que contem 1,8 mL do anolyte e o lado de tomada do capilar em um tubo de ensaio que contem 1,8 mL de católito e que aplica um potencial elétrico de 25 quilovolts através do capilar por 15 Min.
• Os picos focalizados são mobilizados quimicamente durante qual a solução católita é substituída com um tubo de ensaio que contem 1,8 mL do mobilizer químico e que aplica um potencial elétrico de 30 quilovolts através do capilar por 20 Min.
• Após conclusão da etapa da mobilização, o levantamento de dados é parado e uma etapa da lavagem de água é executada submergindo a entrada do capilar em um tubo de ensaio que contem 1,8 mL de água de DDI e que aplica 50 libras por polegada quadrada da pressão do lado da entrada por 2 Min.

O método da parada programada envolve o seguinte:

• O instrumento é fechado e o capilar é armazenado no instrumento no fim do dia de trabalho usando um método da parada programada que equilibre primeiramente o capilar submergindo a entrada do capilar em um tubo de ensaio que contem 1,8 mL da água de DDI e que aplica 50 libras por polegada quadrada da pressão do lado da entrada por 2 Min.
• Após a lavagem de água, uma lavagem de acondicionamento é executada submergindo a entrada do capilar em um tubo de ensaio que contem 1,8 mL do gel do cIEF da Relha de Beckman e que aplica 50 libras por polegada quadrada da pressão do lado da entrada por 10 Min.

Figura 1. Circunstâncias Iniciais.

Figura 2. Ajustes do Detector.

Os tubos de ensaio De Vidro que contêm 1,6 mL de reagentes da separação do cIEF foram colocados nas bandejas do amortecedor antes da separação no pedido ilustrado em Figura 3. A solução capilar da limpeza é designada pela abreviatura do “Solenóide Limpo Tampão.” e mobilizer químico por “Chem. Multidão.” As Setas mostram os reagentes que são incrementados pelo Método de Separação Básico do cIEF do Inclinação do pH e pelo sentido do incremento.

Figura 3. Instalação da Bandeja do Amortecedor.

A escala e as linearidades eficazes da separação para o pH protegido ampholyte são factores essenciais no cIEF. As separações do cIEF de um painel de marcadores sintéticos do peptide com os pontos do pi que medem a escala do pH de 4,1 a 10 (Tabela 3) foram executadas usando o método básico da escala do pH para avaliar linearidades. Esta separação (Fig. 4) mostra que o método tem uma escala funcional larga e é mesmo capaz de separar os marcadores ácidos do peptide quando o tempo de mobilização é prolongado.

Tempos de Detecção do Marcador do pi da Tabela 3. Contem os pontos do pi, as seqüências de ácido aminado e os tempos de detecção para a separação dos marcadores do pi em Figura 4.

Figura 4. Separações do cIEF de Marcadores Sintéticos do pi do Peptide. Contem um electropherogram de sete marcadores sintéticos do peptide usando o método de separação básico do cIEF do inclinação do pH. A etapa da mobilização era prolongada de 35 a 40 minutos permitir a detecção do marcador do pi 4,1.

A Análise do pi contra o tempo de detecção (Fig. 5) para os marcadores sintéticos do peptide mostra que o inclinação é linear entre o pH 10 e 4,1 com um coeficiente de correlação de 0,99. As espécies Altamente básicas da proteína focalizadas não correctamente são confundidas às vezes como partes dianteiras de sal. Isto é mostrado em Figura 4 como os pre-picos catódicos.

Figura 5. Modelo Linear do Marcador do pi. Um lote de valores do pi contra o tempo de detecção observado para a separação de peptides sintéticos como resumido na Tabela 1. A mobilização dos marcadores do pi cabe um modelo linear com um coeficiente de correlação de 0,99 que indicam que o inclinação mobilizado do pH é altamente linear.

os mAbs tendem a gerar perfis complexos do isoform da carga quando separados pelo cIEF. Estes perfis além do que valores reais do pi para os picos geram uma impressão digital do “mAb”. É por esta razão que o cIEF pode ser uma ferramenta poderosa na identificação e na caracterização de preparações separadas do mAb. O perfil máximo original para mAbs diferentes mostra que um único método usando um pH largo 3 a mistura do ampholyte 10 é capaz de resolver diferenças no pi até alguns centésimo de 1 unidade do pH através da escala básica do inclinação (Fig. 6).

Figura 6. Separações do cIEF de Três mAb Básicos. Os Electropherograms para três mAbs básicos separaram pelo cIEF usando as mesmas circunstâncias segundo as indicações de Figura 4.

A fim testar a precisão intermediária para este método, um painel de três anticorpos foi separado em dois instrumentos usando dois lotes diferentes do capilar neutro e reagentes em seis dias separados. Todos Os dados foram integrados usando o software de 32 KaratTM. o pi era determinado através da ferramenta de análise qualitativa usando os tempos de detecção de marcadores sintéticos do peptide do pi 10 e 7. Os picos foram agrupados em um de três grupos do isoform para cada mAb, básico, principal e ácido, e uma composição dos por cento foi calculada para cada grupo do isoform (Figos. 7-9). O ponto do pi de sete picos da assinatura e a composição dos por cento de três grupos do isoform para cada um dos três mAbs testados foram gravados. Estes valores gravados foram usados então para calcular os coeficientes dos por cento de variação (%CV) que foram usados para calibrar a reprodutibilidade do ensaio.

Figura 7. Perfil Máximo do mAb (1). Um fim acima da ideia da separação do cIEF do mAb #1.

Análise Quantitativa da Tabela 4. da Separação do cIEF do mAb #1. A análise Quantitativa foi executada usando o ponto do pi de sete picos da assinatura e a composição dos por cento de três grupos do isoform.

Figura 8. Perfil do Pico do mAb #2. Um fim acima da ideia de uma separação do cIEF do mAb #2.

A Análise Quantitativa da Tabela 5. da análise Quantitativa do mAb #2. foi executada usando o mesmo método que mAb #1.

Figura 9. Perfil do Pico do mAb #3. Um fim acima da ideia de uma separação do cIEF do mAb #3.

A Análise Quantitativa da Tabela 6. da análise Quantitativa do mAb #3. foi executada usando o mesmo método que mAb #1.

Um único método de separação pode ser empregado para executar a análise do cIEF de mAbs múltiplos através de uma escala larga do pH. O uso de um único método permite a preparação das misturas mestras da separação que podem ajudar a se reduzir introduzir com pipeta erros e ariability da inter-amostra. Os Trabalhos são simplificados usando um método da plataforma, reduzindo as possibilidades para o erro de operador e aumentando a eficiência total na revelação do método. A potência analítica da técnica de separação do cIEF é ilustrada pelos três perfis máximos muito diferentes produzidos em cada separação do mAb. A reprodutibilidade do método de separação foi demonstrada conduzindo uma série de separações em seis dias separados usando instrumentos múltiplos com lotes múltiplos dos reagentes. A análise Estatística do pi e da composição dos por cento do grupo do isoform confirma que as separações altamente reprodutíveis do cIEF de mAbs podem ser conseguidas mesmo na região básica previamente problemática do inclinação do pH.