Высокое cIEF Разрешения Терапевтических Моноклональных Антител от пэ-аш 4 до 10

Разъединение изоэлектрический фокусировать (cIEF) Капилляра для характеризовать терапевтические протеины все больше и больше было принято в недавних летах. Определение pI добавляет критический размер к устанавливать тождественность, очищенность, столб-поступательное изменение и стабилность терапевтических подготовок протеина. Значительно пропорция анализов cIEF будучи унесенной в biopharmaceutical индустрии включает характеризацию моноклональных антител (mAbs). Много mAbs имеют isoforms обязанности с pI в основном ряде градиента пэ-аш. Основные смеси предлагают возможность в cIEF должном к недостаточной природе ampholytes состоя из основных зоны так же, как спада градиента пэ-аш отверстия над временем. Добавление катодных и анодных стабилизаторов к помощи разрешения образца cIEF отжимает эти препоны. Дополнительно, оптимизирование томов разрешения стабилизатора, фокусируя времена, и концентрация амфолита включают развитие одиночного метода который можно использовать повсеместно в полный ряд пэ-аш. Эта стратегия включает развитие одиночного протокола для характеризации трубопровода продукта также названной метод платформы. Это важный аспект должный к потребности для простоты и многосторонности в biopharmaceutical индустрии. Результат этих усилий развитие робастного и портативного аналитически метода более менее пронального к изменению ошибки или системы оператора.

Подготовка образцов mAb выполнена как перечислено ниже:

• 500 томов mL основного терапевтического mAb (5-10 mg/mL) растаян и нагружен в Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530, Millipore, Billerica, MA).
• После центрифугирования на минута 5 в Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Предплужник, Inc., Fullerton, CA) на rcf 12 k, фильтрованный том заменен с пэ-аш 8,0 буфера 20 mM Tris.
• Сделаны 2 дополнительных цикла замены центрифугирования и буфера и desalted образец aliquoted в приблизительно 50 частей mg и сохранен на °C -20 или ниже.

Следующие шаги выполнены по отношению к капиллярам и реагентам:

• Удостоверение личности mm Предплужника 50 Beckman. Нейтральный Капилляр (p/n 477441) установлен в Патрон Капилляра оборудованный с 200 aperture mm.
• Перед установкой, капилляр был измерен так как своя полная длина была 30,2 cm и длина от входа к окну обнаружения была 20 cm и от выхода к окну обнаружения были 10 cm.
• Разрешения Anolyte содержа 200 mM фосфорной кислоты были подготовлены по мере того как большое часть 40 mL, путем разбавлять 550 mL 85% (w/v) (14,6 M) фосфорная кислота (Сигма 438081) с 39,5 mL двойн-деионизированной (DDI) воды.
• Catholyte разрешения содержа 300 mM окисоводопода натрия были подготовлены по мере того как большое часть 40 mL путем разбавлять 12 mL окисоводопода натрия 1 M (Сигмы p/n 72082) в 28 mL воды DDI.
• Химические разрешения mobilizer содержа 350 mM укусной кислоты были подготовлены по мере того как большое часть 40 mL путем разбавлять 0,8 mL ледяной уксусной кислоты (99,8%), 17,4 M (Сигму p/n 537020) в 39 mL воды DDI.

Подготовка Смешивания Таблицы 1. Мастерская. Разрешение смешивания оригинала cIEF было сделано путем смешивать соотвествующие компонентные тома. Эти тома включают том overage 20% для учета капать ошибку из пипетки. Одиночный состав части мастерского смешивания содержал 12 mL Pharmalyte* 3-10 (Медицинское Соревнование p/n 17-0456-01 GE), 20 mL 500 mM L-Аргинина, 2 mL 200 mM ИДА, 1,0 mL отметок pI пептида 1,25 mM, и 200 mL Геля ureacIEF 3 M.

Шаги следовать для того чтобы получить разрешение чистки капилляра перечислены ниже:

• Разрешение чистки Капилляра было сделано как навальное разрешение путем растворяя g 10,8 мочевины (Сигмы p/n U0631) в 30 mL воды DDI.
• Разрешение чистки Капилляра было смешанно до тех пор пока все твердые тела не растворят и после этого были фильтрованы до Acrodisc* фильтр шприца 25 mm с порой 5-mm (Завесой p/n 4199) для того чтобы извлечь частицы.
• Разрешению геля мочевины-cIEF 3 M было подготовлено путем растворяя g 1,80 мочевины (Сигмы p/n U1250) в 9 mL геля cIEF (p/n 477497), было смешано для 15 минимального и было нагружено в шприц 30-mL (Becton Dickenson p/n 309650) и после этого фильтровано используя пору Acrodisc 5-mm фильтр шприца 25 mm (Завесу p/n 4199) для того чтобы извлечь частицы.
• Разрешение геля мочевины-cIEF 3 M было дегазировано на rcf 2.000 с Allegra X центробежка 15 R (Предплужник p/n 392933 Beckman) и сохранено на 2-8 °C.
• Катодное разрешение стабилизатора состоя из 500 mM Larginine было сделано по мере того как большое часть 50 mL сперва растворяя 4,36 g из L-Аргинина (98%) (Сигма p/n A5006) твердое тело с 35 mL воды DDI в склянке 50 mL объемной, тогда объемная склянка была сотрясана на минута 15 для того чтобы растворить и окончательно увеличивающ том до 50 mL с водой DDI.
• Анодное разрешение стабилизатора содержа 200 mM iminodiacetic кислоты (IDA) было сделано по мере того как большое часть 50 mL сперва растворяя g 1,33 iminodiacetic кисловочного (98%) (Сигма p/n 220000) твердое тело с 35 mL воды DDI в склянке 50 mL объемной.
• Смесь была сотрясана на минута 15 для того чтобы растворить все твердые тела и том был увеличен до 50 mL используя воду DDI.
• Разрешение замены буфера mAb которое содержало 20 mM Tris было сделано путем разбавлять 4 mL буфера 50 mM Tris на пэ-аш 8,0 (p/n 477427) с 6 mL воды DDI.

Подготовка Образца Таблицы 2. Следовать смешивать смешивания mL 240 мастерского, было добавлено к пробке содержа аликвот desalted mAb. Полное разрешение образца после этого было vortexed, 200 mL было перенесено в пробку PCR, было overlaid с одиночным падением минеральномасляного (Сигма p/n 8410-5ML) и было помещено в пробирке образца.

Конфигурация аппаратуры следующим образом:

Подготовляя следовать процедура перечислена ниже:

• После начальной установки патрона капилляра, нейтральный капилляр подготовлен сперва выполнять rinse воды путем погружать вход в воду капилляра в стеклянную пробирку содержа 1,8 mL воды DDI и прикладывая 50 psi давления от стороны входа на 2 MIN.
• Выдвинутый rinse воды следовать мытьем слабой кислоты выполненным путем погружать вход в воду капилляра в пробирку содержа 1,8 mL химического mobilizer и прикладывая 50 psi давления от стороны входа на 2 MIN.
• Окончательно подготовляя rinse выполнен путем погружать вход в воду капилляра в пробирку содержа 1,8 mL геля cIEF Предплужника Beckman и прикладывая 50 psi давления от стороны входа на 5 MIN.

Образцы mAb были отделены используя следующий метод разъединения:

• Капилляр сперва очищен путем погружать вход в воду капилляра в пробирку содержа 1,8 mL разрешения чистки капилляра и придавая давление на 50 psi от стороны входа на 3 MIN.
• После шага rinse разрешения чистки капилляра, капилляр потоплен с водой путем погружать вход в воду капилляра в пробирку содержа 1,8 mL воды DDI и прикладывая 50 psi давления от стороны входа на 2 MIN.
• Разрешение образца mAb CIEF введено в капилляр путем прикладывать 25 psi давления на sec 99,9 от стороны входа капилляра.
• Во Время чистки, шаги нагрузки rinse воды и образца, сторона выхода капилляра помещены в неныжную пробирку.
• После впрыски образца, градиент сфокусирован путем погружать сторону входа капилляра в пробирку содержа 1,8 mL anolyte и сторону в воду выхода капилляра в пробирку содержа 1,8 mL catholyte и прикладывая потенциал 25 kV электрический через капилляр на 15 MIN.
• Сфокусированные пики мобилизованы химически во время чточто catholyte разрешение заменено при пробирка содержа 1,8 mL химического mobilizer и прикладывая потенциал 30 kV электрический через капилляр на 20 MIN.
• После завершения шага мобилизации, сбор данных остановлен и шаг rinse воды выполнен путем погружать вход в воду капилляра в пробирку содержа 1,8 mL воды DDI и прикладывая 50 psi давления от стороны входа на 2 MIN.

Метод выключения включает следующее:

• Аппаратура выключена и капилляр хранится на аппаратуре в конце рабочего дня используя метод выключения который сперва эквилибрировал капилляр путем погружать вход в воду капилляра в пробирку содержа 1,8 mL воды DDI и прикладывая 50 psi давления от стороны входа на 2 MIN.
• После rinse воды, подготовляя rinse выполнен путем погружать вход в воду капилляра в пробирку содержа 1,8 mL геля cIEF Предплужника Beckman и прикладывая 50 psi давления от стороны входа на 10 MIN.

Диаграмма 1. Начальные Условия.

Диаграмма 2. Установки Детектора.

Стеклянные пробирки содержа 1,6 mL реагентов разъединения cIEF были помещены в подносах буфера до разъединения в заказ проиллюстрированный в Диаграмме 3. Разрешение чистки капилляра обозначено аббревиатурой «Sol Крышки Чистым.» и химический mobilizer «Chem. Толпа.» Стрелки показывают реагенты которые инкрементированы Основным Методом Разъединения cIEF Градиента пэ-аш и направлением инкрементировать.

Диаграмма 3. Настроение Подноса Буфера.

Эффективные ряд и линеарности разъединения для пэ-аш амортизированного амфолитом необходимые факторы в cIEF. Разъединения cIEF панели синтетических отметок пептида с pI указывают spanning ряд пэ-аш 4,1 к 10 (Таблица 3) была выполнена используя основной метод интервалов пэ-аш для того чтобы определить линеарности. Это разъединение (FIG. 4) показывает что метод имеет широкий функциональный ряд и даже способен отделять кислотные отметки пептида когда время мобилизации увеличивать.

Времена Обнаружения Отметки pI Таблицы 3. Содержит пункты pI, последовательности аминокислоты и времена обнаружения для разъединения отметок pI в Диаграмме 4.

Диаграмма 4. Разъединения cIEF Синтетических Отметок pI Пептида. Он содержит electropherogram 7 синтетических отметок пептида используя основной метод разъединения cIEF градиента пэ-аш. Шаг мобилизации был продленн от 35 до 40 минут для того чтобы включить обнаружение отметки pI 4,1.

Анализ pI против времени обнаружения (FIG. 5) для синтетических отметок пептида показывает что градиент линейный между пэ-аш 10 и 4,1 с коэффициентом соотношения 0,99. Сильно основные не правильно сфокусированные виды протеина иногда ошиблены как фронты соли. Это показано в Диаграмме 4 как катодные pre-пики.

Диаграмма 5. Линейная Модель Отметки pI. График значений pI против времени обнаружения наблюдаемого для разъединения синтетических пептидов как получено в итоге в Таблицей 1. Мобилизация отметок pI приспосабливает линейную модель с коэффициентом соотношения 0,99 показывая что мобилизованный градиент пэ-аш сильно линейный.

mAbs клонат произвести сложные профили isoform обязанности отделяно cIEF. Эти профили в дополнение к фактическим значениям pI для пиков производят фингерпринт «mAb». Он для этой причины что cIEF может быть мощным инструментом в идентификации и характеризации отдельно подготовок mAb. Уникально пиковый профиль для различных mAbs показывает что одиночный метод используя обширный пэ-аш 3 до смесь амфолита 10 способен разрешать разницы в pI до немного сот 1 блока пэ-аш через основной ряд градиента (FIG. 6).

Диаграмма 6. Разъединения cIEF 3 Основных mAb. Electropherograms для 3 основных mAbs отделились cIEF используя такие же условия как показано в Диаграмме 4.

Для того чтобы испытать промежуточную точность для этого метода, панель 3 антител была отделена на 2 аппаратурах используя 2 различных серии нейтрального капилляра и реагентах на 6 отдельно дней. Все данные были интегрированы используя ПО 32 KaratTM. pI был решительно через инструмент качественного анализа используя времена обнаружения отметок пептида pI 10 и 7 синтетических. Пики были собраны в одну из 3 групп isoform для каждого mAb, основно, главным образом и кислотно, и состав процентов был высчитан для каждой группы isoform (FIGS. 7-9). Были записаны пункт pI 7 пиков подписи и состав процентов 3 групп isoform для каждого из 3 испытанных mAbs. Эти записанные значения после этого были использованы для того чтобы высчитать коэффициенты вариации процентов (%CV) которые были использованы для того чтобы калибровать воспроизводимость assay.

Диаграмма 7. Профиль mAb (1) Пиковый. Конец вверх по взгляду разъединения cIEF mAb #1.

Анализ Таблицы 4. Количественный Разъединения cIEF mAb #1. Количественный анализ был выполнен используя пункт pI 7 пиков подписи и состав процентов 3 групп isoform.

Диаграмма 8. Профиль Пика mAb #2. Конец вверх по взгляду разъединения cIEF mAb #2.

Анализ Таблицы 5. Количественный анализа mAb #2. Количественного был выполнен используя такой же метод как mAb #1.

Диаграмма 9. Профиль Пика mAb #3. Конец вверх по взгляду разъединения cIEF mAb #3.

Анализ Таблицы 6. Количественный анализа mAb #3. Количественного был выполнен используя такой же метод как mAb #1.

Одиночный метод разъединения можно использовать для того чтобы выполнить анализ cIEF множественных mAbs через обширный ряд пэ-аш. Польза одиночного метода включает подготовлять мастерские смешивания разъединения которые могут помочь уменьшить накапать ошибки и ariability из пипетки взаимо--образца. Поток операций упрощен путем использование метода платформы, уменьшая шансы для ошибки оператора и увеличивая полную производительность в развитии метода. Аналитически сила метода разъединения cIEF проиллюстрирована 3 очень различными пиковыми профилями произведенными в каждом разъединении mAb. Воспроизводимость метода разъединения была продемонстрирована путем дирижировать серию разъединений на 6 отдельно дней используя множественные аппаратуры с множественными сериями реагентов. Статистический анализ состава процентов группы pI и isoform подтверждает что сильно возпроизводимых разъединений cIEF mAbs можно достигнуть даже в ранее проблемной основной зоне градиента пэ-аш.