KickUpplösningscIEF av Terapeutiska Monoclonal Antikroppar från pH 4 till 10

Har avskiljandet för isoelectric fokusering (cIEF) för Capillary för att karakterisera terapeutiska proteiner adopterats mer och mer under senare år. Beslutsamheten av pI tillfogar ett kritiskt dimensionerar till upprättande av identitet, av renhet, av posta-translational ändring och av stabilitet av terapeutiska proteinförberedelser. Ett viktigt proportionerar av cIEFanalyser som ut bärs i den biopharmaceutical branschen, gäller karakterisering av monoclonal antikroppar (mAbs). Många mAbs har laddningsisoforms med en pI i det grundläggande att spänna av pH-lutningen. Grundläggande sammansättningar erbjuder en utmaning i cIEF tack vare den otillräckliga naturen av ampholytes som består av den grundläggande regionen såväl som, förfaller av spela golfboll i hålpH-lutningen med tiden. Tillägget av cathodic och anodic stabilisatorer till cIEFen tar prov betagen lösningshjälp dessa hinder. Dessutom möjliggör optimization av stabilisatorlösningsvolymer, fokuserande tider och ampholytekoncentration utveckling av en singelmetod som kan vara den använda alltigenom som, den färdiga pHen spänner. Denna strategi möjliggör utvecklingen av ett singelprotokoll för produktpipelinekarakteriseringen som ses också till som en plattformmetod. Detta är ett viktigt pekar tack vare behovet för enkelhet och versatility i den biopharmaceutical branschen. Resultatet av dessa försök är utvecklingen av en robustt och bärbar analytisk teknik som mindre är benägen till variation för operatörsfelet eller system.

Förberedelsen av mAb tar prov utförs som listad nedanfört:

• En 500 mLvolym av en grundläggande terapeutisk mAb (5-10 mg/mL) töas och laddas in i en Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530, Milliporen, Billerica, MOR).
• Efter centrifugation för minut 5 i en Microfuge 18 (p/n 367160, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) på rcf för 12 K byts ut den filtrerade volymen med 20 som en mm Tris fungera som buffert pH 8,0.
• Extra Två cyklar av centrifugation och fungera som buffert utbytet göras, och de desalted tar prov aliquoteds in i ungefärligt 50 mg del och lagrade på °C -20 eller nedanfört.

Kliver efter utförs med hänsyn till capillaries och reagents:

• En en mm ID för Beckman Coulter 50. FrilägeCapillaryen (p/n 477441) installeras i en CapillaryKassett som utrustas med en 200 en mmaperture.
• För installation mättes capillaryen, så att dess sammanlagda längd var 30,2 cm, och längden från öppning till upptäcktsfönstret var 20 cm, och från uttaget till upptäcktsfönstret var 10 cm.
• Anolyte lösningar som innehåller phosphoric syra för en mm 200, var förberedda, som en 40 mL i stora partier, genom att förtunna 550 mL av 85% (w/v) (14,6 M) phosphoric syra (Sigma 438081) med 39,5 mL av dubblett-deionized, (DDI) bevattnar.
• Catholyte lösningar som innehåller natriumhydroxide för en mm 300, var förberedda, som en 40 mL i stora partier, genom att förtunna 12 mL av 1 M natriumhydroxide (Sigmaen p/n 72082) in i 28 mL DDI, bevattnar.
• Kemiska mobilizerlösningar som innehåller ättiksyra för en mm 350, var förberedda, som en 40 mL i stora partier, genom att förtunna 0,8 mL av is- ättiksyra (99,8%), 17,4 M (Sigmaen p/n 537020) in i 39 mL av DDI, bevattnar.

Bordlägga 1. Styra BlandningFörberedelsen. En ledar- blandninglösning för cIEF gjordes, genom att blanda de del- volymerna för anslå. Dessa volymer inkluderar en 20% overagevolym för att redogöra för pipetting av fel. Singeln portionr sammansättning av den ledar- blandningen innehöll 12 mL av Pharmalyte* 3-10 (GE Sjukvården p/n 17-0456-01), 20 mL av 500 en mmL-Arginine, 2 mL av 200 en mm IDA, 1,0 mL av markörer 1,25 för en mmpeptidepI och 200 mL av den 3M ureacIEFGelen.

Kliver följt för att erhålla capillarylokalvårdlösningen är listat nedanfört:

• Capillarylokalvårdlösningen gjordes, som en bulk lösning, genom att upplösa G 10,8 av urea (Sigmaen p/n U0631) i 30 mL av DDI, bevattnar.
• Capillarylokalvårdlösningen var blandad till alla upplöste heltäckande och filtrerades därefter till och med en Acrodisc* 25 en mminjektionsspruta filtrerar med en 5-mmpor (Båren p/n 4199) för att ta bort partiklar.
• En lösning för 3M urea-cIEFgel var förberedd, genom att upplösa G 1,80 av urea (Sigmaen p/n U1250) i 9 mL av cIEFgelen (p/n 477497), blandat för minimum 15, och laddat in i en injektionsspruta 30-mL (Becton Dickenson p/n 309650) och därefter filtrerat genom att använda en injektionsspruta för den 5-mmporAcrodisc 25 en mm filtrera (Båren p/n 4199) för att ta bort partiklar.
• Lösningen för den 3M urea-cIEFgelen degassed på rcf 2.000 med en Allegra X centrifugen för 15 R (den Beckman Coulteren p/n 392933) och lagrades på 2-8 °C.
• Den Cathodic stabilisatorlösningen som består av 500 en mm Larginine, gjordes, som en 50 mL i stora partier, genom först att upplösa G 4,36 av L-Arginine (98%) (Sigmaen p/n A5006) heltäckande med 35 mL av DDI, bevattnar i 50 mL en volymetrisk flaska, då den volymetriska flaskan för att skakades minut 15 ska upplösa, och slutligen ökande bevattnar volymen till 50 mL med DDI.
• Den Anodic stabilisatorlösningen som innehåller iminodiacetic syra för en mm 200, (IDA) gjordes, som en 50 mL i stora partier, genom först att upplösa G 1,33 av iminodiacetic syrliga (98%) (Sigmaen p/n 220000) heltäckande med 35 mL DDI, bevattnar i 50 mL en volymetrisk flaska.
• Blandningen skakades för att minut 15 ska upplösa alla heltäckande, och volymen ökades till 50 mL som använder DDI, bevattnar.
• MAbna fungera som buffert utbyteslösningen som innehöll 20 som, en mm Tris gjordes, genom att förtunna 4 mL av 50, en mm Tris fungera som buffert på pH 8,0 (p/n 477427) med 6 mL av DDI bevattnar.

Bordlägga 2. Ta Prov Förberedelsen. Blandning Efter av den ledar- blandningen för mL 240, tillfogades den till ett rör som innehåller en heltalsfaktor av desalted mAb. De färdiga tar prov lösningen vortexed därefter, överfördes 200 mL in i ett PCR-rör som överdrades med en singel, tappa av mineralolja (Sigmaen p/n 8410-5ML) och förlagt i en ta provliten medicinflaska.

Konfigurationen av instrumentera är som följer:

Det följda villkora tillvägagångssättet är listat nedanfört:

• Efter initial installation av capillarykassetten villkoras frilägecapillaryen, genom först att utföra en bevattna, sköljer, genom att doppa öppningen av capillaryen in i en glass liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL av DDI, bevattnar, och applicera 50 PSI av pressa från öppningssidan för minut 2.
• De fördjupade bevattnar sköljer följs av en svag syrlig wash som utförs, genom att doppa öppningen av capillaryen in i en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL av den kemiska mobilizeren, och applicera 50 PSI av pressa från öppningssidan för minut 2.
• Slutligen sköljer villkora utförs, genom att doppa öppningen av capillaryen in i en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL av gelen för Beckman CoultercIEF, och applicera 50 PSI av pressa från öppningssidan för minut 5.

MAben tar prov avskildes genom att använda efter avskiljandemetoden:

• Capillaryen göras först ren, genom att doppa öppningen av capillaryen in i en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL av capillarylokalvårdlösningen, och applicera pressa på 50 PSI från öppningssidan för minut 3.
• Efter sköljer capillarylokalvårdlösningen kliver, spolas capillaryen med bevattnar, genom att doppa öppningen av capillaryen in i en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL DDI, bevattnar, och applicera 50 PSI av pressa från öppningssidan för minut 2.
• MAbna CIEF tar prov lösningen introduceras in i capillaryen, genom att applicera 25 PSI av, pressar för sekund 99,9 från öppningssidan av capillaryen.
• Bevattna sköljer och tar prov att ladda kliver, uttagsidan av capillaryen förläggas in i en förlorad liten medicinflaska Under lokalvården.
• Efter ta prov injektionen, fokuseras lutningen, genom att doppa öppningssidan av capillaryen in i en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL av anolyte och uttagsidan av capillaryen in i en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL av catholyte och applicerar ett 25 elektriskt potentiellt för kV över capillaryen för minut 15.
• Fokuserad nå en höjdpunkt mobiliseras chemically under vilket den catholyte lösningen byts ut med en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL av den kemiska mobilizeren och applicerar ett 30 elektriskt potentiellt för kV över capillaryen för minut 20.
• Och applicera 50 PSI av pressa från öppningssidan för minut 2, Efter avslutning av mobilizationen har klivit, stoppas datasamlingen, och en bevattna sköljer kliver utförs, genom att doppa öppningen av capillaryen in i en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL DDI, bevattnar.

Avstängningsmetoden gäller efter:

• Instrumentera stängs av, och capillaryen lagras på instrumentera på avsluta av den funktionsdugliga dagen genom att använda en avstängningsmetod som hålla i jämvikt först capillaryen, genom att doppa öppningen av capillaryen in i en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL av DDI, bevattnar, och applicera 50 PSI av pressa från öppningssidan för minut 2.
• Och applicera 50 PSI av pressa från öppningssidan för minut 10, Efter bevattna har sköljt, sköljer villkora utförs, genom att doppa öppningen av capillaryen in i en liten medicinflaska som innehåller 1,8 mL av gelen för Beckman CoultercIEF.

Figurera 1. Initialt Villkorar.

Figurera 2. AvkännareInställningar.

Glass liten medicinflaska som innehåller 1,6 mL av cIEFavskiljandereagents, förlades i fungera som buffertmagasinen före avskiljande i beställa som in illustrerades, Figurerar 3. Capillarylokalvårdlösningen designeras av förkortningen ”Ren Solenoid för Locket.”, och kemisk mobilizer vid ”Chem. Folkhop.”, Pilar visar reagentsna som ökas av den Grundläggande Metoden för Avskiljandet för pH-LutningcIEF och riktningen av att öka.

Figurera 3. Fungera som buffert Magasinet Ställer In.

Det effektiva avskiljandet spänner, och linjäriteter för den ampholyte fungera som buffert pHen är nödvändiga dela upp i faktorer i cIEF. CIEFavskiljandena av en panel av syntetmaterialpeptidemarkörer med pI pekar att spänna över pHen spänner av 4,1 till 10 (Bordlägga 3), utfördes genom att använda den grundläggande pHen spänner metod för att bedöma linjäriteter. Detta avskiljande (Fig. 4) visar, att metoden har ett brett funktionellt att spänna och är även kapabelt av att avskilja de acidic peptidemarkörerna, när mobilizationtiden är fördjupad.

Bordlägga 3. Tider för pI-MarkörUpptäckt. Innehåller pIen pekar, ordnar amino syra, och upptäckt tajmar för pI-markörerna som avskiljandet Figurerar in 4.

Figurera 4. cIEFAvskiljanden av Markörer för SyntetmaterialPeptidepI. Den innehåller en electropherogram av sju syntetmaterialpeptidemarkörer genom att använda den grundläggande metoden för avskiljandet för pH-lutningcIEF. Mobilizationen kliver var fördjupad från 35 till 40 noterar för att möjliggöra upptäckten av markören för pI 4,1.

Analys av upptäcktstid för pI (Fig. 5) för syntetmaterialpeptidemarkörerna visar kontra att lutningen är linjär mellan pH 10 och 4,1 med en korrelation som är samverka av 0,99. Den Högt grundläggande proteinarten inte riktigt fokuserad missförstås ibland, som salt beklär. Detta visas in Figurerar 4, som det cathodic pre-nå en höjdpunkt.

Figurera 5. den Linjära pI-Markören Modellerar. En täppa av pI värderar kontra upptäcktstid som observeras för avskiljande av syntetmaterialpeptides, som resumerat in Bordlägga 1. Mobilizationen av pI-markörpassformarna som ett linjärt modellerar med en korrelation som är samverka av 0,99 som indikerar att den mobiliserade pH-lutningen är högt linjär.

mAbs ansar för att frambringa komplex laddningsisoform profilerar, när de avskiljs av cIEF. Dessa profilerar förutom faktisk pI värderar för nå en höjdpunkt frambringar ”en mAb” identifierar med fingeravtryck. Det är för detta resonerar att cIEF kan vara ett kraftigt bearbetar i IDet och karakteriseringen av separata mAb-förberedelser. Det unika maximalt profilerar för olika mAbs visar att en singelmetod genom att använda en bred pH 3 till blandningen för ampholyte 10 är kapabel av att lösa skillnader i pI upp till som några hundradelar av 1 pH-enhet över det grundläggande spänner av lutningen (Fig. 6).

Figurera 6. cIEFAvskiljanden av Tre Grundläggande mAb. Electropherograms för tre grundläggande mAbs som avskiljs av cIEF som använder samma, villkorar, som visat in Figurera 4.

För att testa mellanliggande precision för denna metod, avskildes en panel av tre antikroppar på två instrumenterar genom att använda frilägecapillaryen och reagents för två den olika raddor på sex separata dagar. Alla data integrerades genom att använda programvara för 32 KaratTM. pI var beslutsam till och med den kvalitativa analysen bearbetar genom att använda upptäcktstiderna av för syntetmaterialpeptiden för pI 10 och 7 markörer. Nå en höjdpunkt grupperades in i en av tre isoformgrupper för varje mAb, grundläggande, huvudsakligt och acidic, och en procentsammansättning beräknades för varje isoformgrupp (Figs. 7-9). PIna pekar av sju som häftet nå en höjdpunkt, och procentsammansättningen av tre isoformgrupper för varje av de tre testade mAbsna antecknades. Antecknade Dessa värderar var van vid beräknar därefter procentkoefficienter av variation (%CV) som var van vid mätinstrumentanalysreproducibility.

Figurera 7. Maximala mAb (1) Profilerar. Ett slut beskådar upp av cIEFavskiljandet för mAb #1.

Bordlägga 4. Kvantitativ Analys av cIEFAvskiljandet för mAb #1. Kvantitativ analys utfördes genom att använda pIen pekar av sju som häftet nå en höjdpunkt och procentsammansättningen av tre isoformgrupper.

Figurera 8. Maximala mAb #2 Profilerar. Ett slut beskådar upp av ett cIEFavskiljande för mAb #2.

Bordlägga 5. Kvantitativ Analys av mAb #2. Kvantitativ analys utfördes genom att använda den samma metoden som mAb #1.

Figurera 9. Maximala mAb #3 Profilerar. Ett slut beskådar upp av ett cIEFavskiljande för mAb #3.

Bordlägga 6. Kvantitativ Analys av mAb #3. Kvantitativ analys utfördes genom att använda den samma metoden som mAb #1.

En singelavskiljandemetod kan användas för att utföra cIEFanalys av multipelmAbs över en bred pH spänner. Bruket av en singelmetod möjliggör att förbereda ledar- avskiljandeblandningar som kan hjälpa att förminska pipetting fel och inter-att ta prov ariability. Workflowen förenklas, genom att använda en plattformmetod, förminskande riskerar för operatörsfel och ökande total- effektivitet i metodutveckling. Det analytiskt driver av cIEFavskiljandetekniken illustreras av det tre mycket olika maximalt profilerar producerat i varje mAb-avskiljande. Reproducibilityen av avskiljandemetoden visades, genom att föra en serie av avskiljanden på sex separata dagar som använder multipel, instrumenterar med multipelraddareagents. Statistisk analys av sammansättning för pI- och isoformgruppprocent bekräftar att högt reproducible cIEFavskiljanden av mAbs kan uppnås även i den föregående problematiska grundläggande regionen av pH-lutningen.