治疗单克抗体高分辨率 cIEF 从酸碱度 4 的到 10

分析的治疗 (cIEF)蛋白质血丝等电子聚焦分隔近年来越来越采用。pI 的确定添加重要维数到设立身分、纯度、之后平移治疗蛋白质准备的修改和稳定性。 cIEF 分析的一个重要比例在这个 biopharmaceutical 行业被执行的介入单克抗体 (mAbs) 的描述特性。 许多 mAbs 有与 pI 的充电 isoforms 在酸碱度梯度的基本的范围。 基本的化合物提供在 cIEF 的一个挑战由于随着时间的推移包括基本的区域以及朽烂的 ampholytes 的不适于的本质漏洞酸碱度梯度。 负极和正极安定器的添加对 cIEF 范例解决方法帮助的克服这些阻碍。 另外，安定器解决方法数量的优化，集中的时代和两性电解物含量启用可以使用在完全酸碱度范围中一个唯一方法的发展。 此方法启用一个唯一协议的发展产品也指平台方法传递途径描述特性的。 这简而言之是重点由于在这个 biopharmaceutical 行业的需要和通用性。 这些工作成绩的结果是一个稳健和可移植的分析技术的发展较不倾向对操作员错误或系统差异。

mAb 范例的准备进行如下所示：

• 基本的治疗 mAb (5-10 mg/mL) 的一个 500 个 mL 数量被解冻并且被装载到 Microcon* Ultracell YM 10 (p/n A11530，微孔， Billerica， MA)。
• 在 5 分钟的离心法以后在 12 个 k rcf 的 Microfuge 18 (p/n 367160， Beckman Coulter， Inc.， Fullerton，加州)，这个被过滤的数量用 20 mM Tris 缓冲酸碱度 8.0 替换。
• 离心法和缓冲替换的二个另外的循环完成，并且这个脱盐的范例 aliquoted 到大约 50 个 mg 分数并且存储在 -20 °C 以下。

下列步骤执行关于血丝和试剂：

• Beckman 犁刀 50 mm i.d。 中立血丝 (p/n 477441) 在用 200 mm aperture 装备的一个血丝子弹被安装。
• 在安装前，血丝被评定了，以便其总长度是 30.2 cm，并且长度从入口到检测视窗是 20 cm，并且从出口到检测视窗是 10 cm。
• 包含 200 mM 的 Anolyte 解决方法磷酸通过稀释 550 mL 准备， 40 mL 批量项目货签， 85% (w/v) (14.6 M) 磷酸 (斯格码 438081) 与 39.5 mL 二重被去离子的 (DDI)水。
• 包含 300 mM 的阴极电解液解决方法氢氧化钠通过稀释 12 mL 准备，当 40 mL 批量项目货签 1 M 氢氧化钠 (斯格码 p/n 72082) 到 28 mL DDI 水。
• 包含 350 mM 的化工运动员解决方法乙酸通过稀释 0.8 mL 准备，当 40 mL 批量项目货签冰河乙酸 (99.8%)， 17.4 M (斯格码 p/n 537020) 到 39 mL DDI 水里。

表 1. 主要混合准备。 cIEF 重要资料混合解决方法通过混合适当的组件数量做。 这些数量包括一个 20% 过剩数量占吸取错误。 唯一部分结构的主要混合包含了 12 mL Pharmalyte* 3-10 (GE 医疗保健 p/n 17-0456-01)， 500 mM 20 mL L 氨基胍基戊酸， 200 mM IDA 2 mL， 1.25 mM 肽 pI 标记 1.0 mL 和 3 M ureacIEF 胶凝体 200 mL。

按照的步骤获得血丝清洁解决方法如下是列出的：

• 血丝清洁解决方法做作为一个批量解决方法由溶化的 10.8 g 尿素 (斯格码 p/n U0631) 在 30 mL DDI 水。
• 血丝清洁解决方法是混杂的，直到所有固体溶化了和然后过滤有 5-mm 毛孔的 (遮盖物 p/n 4199) Acrodisc* 25 mm 注射器补白去除微粒。
• 一个 3 M 尿素cIEF 胶凝体解决方法由溶化的 1.80 g 尿素准备 (斯格码 p/n U1250) 在 9 mL cIEF 胶凝体 (p/n 477497)，为 15 混合最小并且被装载了到 30 ml 注射器 (Becton Dickenson p/n 309650) 然后被过滤使用 5-mm 毛孔 Acrodisc 25 mm 注射器补白 (遮盖物 p/n 4199) 去除微粒。
• 3 M 尿素cIEF 胶凝体解决方法去除了毒气在 2,000 与 Allegra X 的 rcf 15 R 离心机 (Beckman 犁刀 p/n 392933) 并且存储了在 2-8 个 °C。
• 包括 500 mM Larginine 的负极安定器解决方法由首先溶化的 4.36 g 做， 50 mL 批量项目货签 L 氨基胍基戊酸 (98%) (斯格码 p/n A5006) 与 35 mL 的固体在一个 50 mL 容量瓶的 DDI 水，然后容量瓶被震动在 15 分钟溶化和终于增加这个数量对 50 mL 用 DDI 水。
• 包含 200 mM 的正极安定器解决方法 iminodiacetic 酸 (IDA)由首先溶化的 1.33 g iminodiacetic 酸做， 50 mL 批量项目货签 (98%) (斯格码 p/n 220000) 与 35 mL 的固体在一个 50 mL 容量瓶的 DDI 水。
• 这个混合物被震动在 15 分钟溶化所有固体使用 DDI 水，并且这个数量增加到 50 mL。
• 包含 20 mM Tris 的 mAb 缓冲替换解决方法通过稀释 4 mL 做在酸碱度 8.0 (p/n 477427) 的 50 mM Tris 缓冲用 6 mL DDI 水。

表 2. 范例准备。 按照的混合 240 mL 主要混合，被添加了到包含整除数脱盐的 mAb 的管。 完全范例解决方法然后 vortexed， 200 mL 调用了到 PCR 管，用唯一下落矿物油覆盖了 (斯格码 p/n 8410-5ML) 并且安置了在范例小瓶。

仪器的配置是如下：

被仿效的这种适应的做法如下是列出的：

• 在这个血丝子弹的最初安装以后，中立血丝通过首先进行水漂洗适应通过淹没血丝的入口到包含 1.8 mL DDI 水和施加 50 psi 压的一个玻璃小瓶从入口端 2 Min。
• 延长的水漂洗由弱跟随酸冲洗执行通过淹没血丝的入口到包含 1.8 mL 化工运动员和施加 50 psi 压的小瓶从入口端 2 Min。
• 最终适应的冲洗通过淹没血丝的入口执行到包含 1.8 mL Beckman 犁刀 cIEF 胶凝体和施加 50 psi 压的小瓶从入口端 5 Min。

使用下列分隔方法， mAb 范例分隔：

• 血丝被淹没血丝的入口首先清洗到包含 1.8 mL 血丝清洁解决方法和施加在 50 psi 的小瓶压从入口端 3 Min。
• 从事血丝清洁解决方法冲洗步骤，血丝注满以水被淹没血丝的入口到包含 1.8 mL DDI 水和施加 50 psi 压的小瓶从入口端 2 Min。
• mAb CIEF 范例解决方法被引入到血丝被施加 25 psi 压为 99.9 秒数从血丝的入口端。
• 在清洁期间，水漂洗和范例装载步骤，血丝的出口侧被安置到一个废小瓶。
• 在范例射入以后，这个梯度通过淹没血丝的入口端到包含 1.8 mL anolyte 的小瓶和血丝的出口侧集中到包含 1.8 mL 阴极电解液和适用在血丝间的小瓶 25 kV 电子潜在 15 Min。
• 集中的峰顶被动员化工在哪些期间这个阴极电解液解决方法用包含 1.8 mL 化工运动员和适用在血丝间的小瓶替换 30 kV 电子潜在 20 Min。
• 在完成动员步骤后，数据收集被终止，并且水漂洗步骤通过淹没血丝的入口执行到包含 1.8 mL DDI 水和施加 50 psi 压的小瓶从入口端 2 Min。

关闭方法介入以下：

• 仪器被关闭，并且血丝在仪器存储在工作日结束时使用通过淹没血丝入口首先平均血丝到包含 1.8 mL DDI 水和施加 50 psi 压的小瓶从入口端 2 Min. 的关闭方法。
• 在水漂洗以后，适应的冲洗通过淹没血丝的入口执行到包含 1.8 mL Beckman 犁刀 cIEF 胶凝体和施加 50 psi 压的小瓶从入口端 10 Min。

图 1. 最初的情况。

图 2. 探测器设置。

包含 1.6 mL cIEF 分隔试剂的玻璃小瓶在缓冲盘安置了在分隔之前按在表说明的顺序 3。 血丝清洁解决方法是由缩写 “盖帽干净的 Sol 选定的”。 并且化工运动员 “Chem。 暴民”。 箭头显示由基本的酸碱度梯度 cIEF 分隔方法和增加的方向增加的试剂。

图 3. 缓冲盘设置。

有效分隔范围和线性两性电解物缓冲的酸碱度的是重要系数在 cIEF。 综合肽标记面板的 cIEF 分隔与 pI 的指向跨过酸碱度范围的 4.1 到 10 (表 3) 执行使用基本的酸碱度范围方法估计线性。 此分隔 (图 4) 向显示这个方法有一个宽功能范围并且甚而能够分隔酸性肽标记，当动员时间是延长的。

表 3. pI 标记检测时间。 在表 4. 包含 pI 点、氨基酸顺序和检测时间的 pI 标记分隔。

图 4. 综合肽 pI 标记 cIEF 分隔。 使用基本的酸碱度梯度 cIEF 分隔方法，它包含七个综合肽标记电泳图谱。 动员步骤从 35 是延长的到 40 分钟启用 pI 4.1 标记的检测。

对 pI 的分析与检测时间 (综合肽标记的图 5) 向显示这个梯度是线性的在与相关系数的酸碱度 10 和 4.1 之间 0.99。 高度不适当地集中的基本的蛋白质种类有时弄错作为盐前线。 这在表 4 显示作为负极前峰顶。

图 5. pI 标记线性模型。 pI 值剧情与对综合肽的分隔观察的检测时间如总结表 1。 pI 标记的动员符合一个线性模型表明的相关系数 0.99 被动员的酸碱度梯度是高度线性的。

mAbs 倾向于生成复杂充电 isoform 配置文件，当分隔由 cIEF。 除实际 pI 值之外的这些配置文件峰顶的生成一个 “mAb”指纹。 为此是 cIEF 可以是在单独 mAb 准备的确定和描述特性的一个强大的工具。 不同的 mAbs 的唯一高峰配置文件向显示使用清楚的 PH3 的一个唯一方法对 10 两性电解物混合物能够解决在 pI 上的区别至 1 个酸碱度部件一些百在这个梯度间 (图 6) 的基本的范围的。

图 6. 三个基本的 mAb's cIEF 分隔。 如图 4. 所显示，三基本的 mAbs 的电泳图谱由 cIEF 分隔使用同样条件。

为了为此方法测试半成品精确度，三抗体面板在二台在六不同日的仪器使用二不同许多中立血丝和试剂分隔。 所有数据使用 32 KaratTM 软件是集成。 pI 通过定性分析工具是确定的使用 pI 10 和 7 综合肽标记的检测时间。 峰顶被编组了到每个 mAb 的三个 isoform 组之一，基本，主要和酸性，并且百分比构成为每个 isoform 组 (Figs. 被计算了 7-9)。 pI 点七个签名峰顶和百分比结构的被测试的三 mAbs 中的每一的三个 isoform 组被记录了。 这些记录的值然后用于计算用于衡量检验增殖率的百分比变化参数 (%CV)。

图 7. mAb (1) 高峰配置文件。 mAb #1 cIEF 分隔的视图的关闭。

对 mAb #1 cIEF 分隔的表 4. 定量分析。 使用 pI 点七个签名峰顶和百分比结构的三个 isoform 组，定量分析执行。

图 8. mAb #2 峰顶配置文件。 mAb #2 cIEF 分隔的视图的关闭。

对 mAb #2. 定量分析的表 5. 定量分析执行使用方法和 mAb #1. 一样。

图 9. mAb #3 峰顶配置文件。 mAb #3 cIEF 分隔的视图的关闭。

对 mAb #3. 定量分析的表 6. 定量分析执行使用方法和 mAb #1. 一样。

一个唯一分隔方法可以被使用执行对在一个清楚的酸碱度范围间的多个 mAbs 的 cIEF 分析。 使用一个唯一方法启用准备可能帮助减少吸取错误和相互范例 ariability 的主要分隔混合。 通过使用平台方法，工作流简化，减少操作员错误的机会和增加在方法发展的综合效率。 cIEF 分离技术的分析功率是由在每 mAb 分隔导致的三个非常不同的高峰配置文件说明的。 分隔方法的增殖率通过执行在六不同日的一系列的分隔展示使用有多个许多的多个仪器试剂。 对 pI 和 isoform 组百分比构成的统计分析确认高度 mAbs 的再现 cIEF 分隔甚而在酸碱度梯度的以前有问题的基本的区域可以达到。